血管平滑筋におけるリアノジン受容体アイソフォームの役割の検討

リアノジン受容体は細胞内Ca^<2+>ストアのCa^<2+>放出チャネルとして筋収縮を初めとした種々の細胞機能に重要な役割を果たしている。本研究ではアンチセンス法を用いてタンパク質の発現を抑制させることにより血管平滑筋におけるリアノジン受容体の役割を検討することを試みた。材料にはラット大動脈平滑筋を用いて、酵素処理により平滑筋細胞を単離し通常の方法で初代培養を行った。哺乳類のリアノジン受容体は現在までに3種類のアイソフォーム(RyR1-3)が知られているが、ラット大動脈には3種類すべてのアイソフォームが発現していることが示されている。マウスリアノジン受容体の各アイソフォームのC端付近をコードする塩基配列をもとにプライマーを合成し、これを用いてRT-PCR法を行った。その結果、培養平滑筋細胞においても3種類全てのアイソフォームが発現していることがわかった。しかしながら、各アイソフォームの発現量は異なっているように見えた。またリアノジン受容体に対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところ高分子量のバンドが検出されたことからリアノジン受容体がタンパク質レベルで発現していることが示唆された。しかしながらこの抗体は全てのアイソフォームに対して反応するので今のところ発現しているアイソフォームの同定は出来ていない。現在、アイソフォーム特異的な抗体を作製している段階である。アンチセンス法に必要な各アイソフォームをコードするcDNAの5'端の塩基配列を決定するため、ウサギリアノジン受容体の塩基配列をもとにしたプライマーを用いたRT-PCR法によって得られた産物をプローブとしたスクリーニングを行っている。この塩基配列を決定した後にアンチセンスオリゴを合成して培養平滑筋細胞に投与しその効果を観察する予定である。

リアノジン受容体は細胞内Ca^<2+>ストアのCa^<2+>放出チャネルとして筋収縮を初めとした種々の細胞機能に重要な役割を果たしている。本研究ではアンチセンス法を用いてタンパク質の発現を抑制させることにより血管平滑筋におけるリアノジン受容体の役割を検討することを試みた。材料にはラット大動脈平滑筋を用いて、酵素処理により平滑筋細胞を単離し通常の方法で初代培養を行った。哺乳類のリアノジン受容体は現在までに3種類のアイソフォーム(RyR1-3)が知られているが、ラット大動脈には3種類すべてのアイソフォームが発現していることが示されている。マウスリアノジン受容体の各アイソフォームのC端付近をコードする塩基配列をもとにプライマーを合成し、これを用いてRT-PCR法を行った。その結果、培養平滑筋細胞においても3種類全てのアイソフォームが発現していることがわかった。しかしながら、各アイソフォームの発現量は異なっているように見えた。またリアノジン受容体に対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロットを行ったところ高分子量のバンドが検出されたことからリアノジン受容体がタンパク質レベルで発現していることが示唆された。しかしながらこの抗体は全てのアイソフォームに対して反応するので今のところ発現しているアイソフォームの同定は出来ていない。現在、アイソフォーム特異的な抗体を作製している段階である。アンチセンス法に必要な各アイソフォームをコードするcDNAの5'端の塩基配列を決定するため、ウサギリアノジン受容体の塩基配列をもとにしたプライマーを用いたRT-PCR法によって得られた産物をプローブとしたスクリーニングを行っている。この塩基配列を決定した後にアンチセンスオリゴを合成して培養平滑筋細胞に投与しその効果を観察する予定である。