蛍光プローブによるCa^<2+>放出チャネルタンパク質の機能分担の解明

使用荧光探针阐明 Ca^2+ 释放通道蛋白的功能划分

• 批准号: 10169256
• 负责人: 村山 尚
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10169256/
• 关键词: カルシウムチャネル; 蛍光プローブ; リアノジン受容体; イノシトール3リン酸受容体

細胞内Ca^<2+>ストアは筋収縮や神経伝達,脳の高次機能といった様々な細胞機能に重要な役割を果たしていることが明らかになっている.本研究では細胞内Ca^<2+>ストアに存在するCa^<2+>放出チャネルであるイノシトール3リン酸受容体(IP3R)およびリアノジン受容体(RyR)を生きた細胞内で可視化しその細胞内局在を調べ,細胞内Ca^<2+>濃度変化との同時測定によりこれらのCa^<2+>放出チャネルの役割を明らかにすることを試みた.可視化の方法としてはそれぞれのタンパク質に対する特異的な抗体を作製し,これに蛍光プローブをつけて細胞内に導入することとした.本年度はこの実験の最初の段階である特異的な抗体の作製と蛍光プローブ標識を行った.抗体はIP3RおよびRyRの一次構造の比較から特異的な部位を選んでその部分配列をペプチド合成し,これをウサギに免疫してポリクローナル抗体として得た.現在までにRyRに対しては全てのサブタイプを認識するものおよび各サブタイプ(RyR1-3)特異的な抗体がそれぞれ得られている.これらの抗体は精製後,励起波長の異なる蛍光色素(Cy2,Cy3,Cy5)でそれぞれ標識した。ウエスタンブロットおよび蛍光抗体法により蛍光標識が良好に導入されたことが確認された.同時に,抗体遺伝子をSigle chain Fv fragmentとして細胞内に発現させることも試みた.可視化の方法としてはクラゲの蛍光タンパク質であるgreen fluorescent protein(GFP)との融合タンパク質として発現させる方法を用いた.RyRに対するポリクローナル抗体が作製されたアミノ酸配列をマウスに免疫し,これらマウスのB細胞のcDNAライブラリよりスクリーニングを行った.現在までに一次スクリーニングでそれぞれ数個のポジティブなクローンが得られておりさらにクローニングを進めている段階である.

Intracellular Ca^<2+> 2 ++-free calcium is the most important component of cellular function. In this study, the intracellular Ca^<2 +> release was visualized and the intracellular Ca^<2+> concentration was measured simultaneously with the intracellular Ca^<2 +> release. The method of visualization is to control the specific antibody of the protein, and to introduce the protein into the cell. This year, the first phase of the development of specific antibodies and the identification of light. Comparison of the primary structure of IP3R and RyR. Now, RyR is the only one that can be used to detect all kinds of antibodies specific to RyR1-3. After purification of the antibody, the excitation wavelength of the fluorescent pigment (Cy2, Cy3, Cy5) is different. It is a good way to identify and confirm the presence of light in the body. At the same time, the antibody gene Sigle chain Fv fragment was detected in the cell. The method of visualization is used in the method of discovery of green fluorescent protein(GFP) and fusion protein(GFP).RyR is used in the preparation of antibody for B cell cDNA. Now, there are several different types of products in the market.

项目成果

村山 尚: "続心臓代謝実験法,II受容体に関する実験 (Ryanodine receptor)" 六法出版社,東京, 101-107 (1998)

Takashi Murayama：“继续心脏代谢实验方法，II受体（Ryanodine受体）的实验”Rokupo Publishing，东京，101-107（1998）

Ogawa,Y.: "Comparison of properties of Ca^<2+> release channels between rabbit and frog skeletal muscles" Molecular and Cellular Biochemistry. (in press). (1999)

小川，Y.：“兔子和青蛙骨骼肌之间Ca ^ 2 释放通道的特性比较”分子和细胞生物化学。