肝内マクロファージ由来NOによる肝細胞障害機序の共焦点レーザー顕微鏡を用いた検討

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当申請費により、活性化された肝マクロファージ(Kupffer細胞)と肝細胞の共培養系におけるNO放出動態と肝細胞障害・アポトーシスとの時間的空間的相関およびその制御機構を解明した。炎症性mediators(TNF-α、IFN-γ)によりKupffer細胞を刺激し肝細胞の共培養系におけるNO産生定量(培養上清中nitrite+nitrate濃度)と、肝細胞内ミトコンドリア呼吸能の変化、肝細胞内の細胞膜・核膜障害をHoechst33342とpropidium iodide蛍光を用い、またDNA fragmentation化をfluorescence nick end labeling法にて共焦点レーザー顕微鏡下に可視化、定量した。さらに、NO合成系の関与を裏付けるためにinducible NO synthase(iNOS)に対するアンチセンスプローブや合成阻害剤(L-NAME、aminoguanidine)を用いて抑制実験を行い検討することによりNOの関与を明かにした。またfluorescence in situ hybridization(FISH)法と共焦点レーザー顕微鏡観察を組み合わせることにより、現在まで困難であった共培養系における各細胞内の特異mRNAの発現に対する観察を行うことを可能とした。以上から、Kupfferによる肝細胞DNA障害におけるNOの関与が明かとした。さらに、NOによる肝細胞DNA障害・mutationを見るために直接ラット肝細胞に直接NO donor(SIN-1、SNAP)を投与しDNAの断片化、障害・mutationを観察した。以上の検討からKupffer細胞活性化からNO放出を会した肝細胞DNA障害・アポトーシスの過程を解明する事が可能であった。これらの結果の一部は第30回肝臓病学会東部会・第9回肝類洞壁細胞研究会・アメリカ消化器病学会・アメリカ肝臓病学会において発表した他、論文として国内外の医学雑誌に発表した。現在は、同実験的手法を用いて肝リンパ球の肝細胞障害機序を解明する準備中である。