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肝内マクロファージ由来NOによる肝細胞障害機序の共焦点レーザー顕微鏡を用いた検討

使用共聚焦激光显微镜研究肝内巨噬细胞源性NO对肝细胞损伤的机制

基本信息

批准号：
08770387
负责人：
渡部直行
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770387/
关键词：
肝細胞DNA障害アポトーシス Kupffer細胞 Pit細胞 TNF-α INF-γ NO 共焦点レーザー顕微鏡

项目摘要

当申請費により、活性化された肝マクロファージ(Kupffer細胞)と肝細胞の共培養系におけるNO放出動態と肝細胞障害・アポトーシスとの時間的空間的相関およびその制御機構を解明した。炎症性mediators(TNF-α、IFN-γ)によりKupffer細胞を刺激し肝細胞の共培養系におけるNO産生定量(培養上清中nitrite+nitrate濃度)と、肝細胞内ミトコンドリア呼吸能の変化、肝細胞内の細胞膜・核膜障害をHoechst33342とpropidium iodide蛍光を用い、またDNA fragmentation化をfluorescence nick end labeling法にて共焦点レーザー顕微鏡下に可視化、定量した。さらに、NO合成系の関与を裏付けるためにinducible NO synthase(iNOS)に対するアンチセンスプローブや合成阻害剤(L-NAME、aminoguanidine)を用いて抑制実験を行い検討することによりNOの関与を明かにした。またfluorescence in situ hybridization(FISH)法と共焦点レーザー顕微鏡観察を組み合わせることにより、現在まで困難であった共培養系における各細胞内の特異mRNAの発現に対する観察を行うことを可能とした。以上から、Kupfferによる肝細胞DNA障害におけるNOの関与が明かとした。さらに、NOによる肝細胞DNA障害・mutationを見るために直接ラット肝細胞に直接NO donor(SIN-1、SNAP)を投与しDNAの断片化、障害・mutationを観察した。以上の検討からKupffer細胞活性化からNO放出を会した肝細胞DNA障害・アポトーシスの過程を解明する事が可能であった。これらの結果の一部は第30回肝臓病学会東部会・第9回肝類洞壁細胞研究会・アメリカ消化器病学会・アメリカ肝臓病学会において発表した他、論文として国内外の医学雑誌に発表した。現在は、同実験的手法を用いて肝リンパ球の肝細胞障害機序を解明する準備中である。

When the application fee is applied, the activation of liver cells (Kupffer cells) and the co-culture system of liver cells, the dynamics of NO emission and the time and space of liver cell damage are explained. Inflammatory mediators(TNF-α, IFN-γ) stimulate Kupffer cells, quantify NO production (nitrite+nitrate concentration in culture supernatant) in co-culture of hepatocytes, change of respiratory energy in hepatocytes, change of cell membrane and nuclear membrane barrier in hepatocytes by Hoechst33342 and propidium iodide, use of light, DNA fragmentation, fluorescence nick end labeling, confocal microscopy visualization and quantification. The relationship between NO synthesis system and synthesis inhibitor (L-NAME, aminoguanidine) is discussed. Fluorescence in situ hybridization(FISH) method is used to detect the expression of specific mRNA in each cell. The above mentioned NO and Kupffer are related to DNA damage of liver cells. DNA fragmentation, DNA mutation and NO donor(SIN-1, SNAP) in hepatocytes were observed. The above discussion of Kupffer cell activation, NO emission and hepatocyte DNA damage and degradation process may be explained. The first part of this paper is the Eastern Conference of the 30th Liver Disease Society, the 9th Liver Cell Research Society, the Digestive Disease Society, the Liver Disease Society, and the International Medical Journal. Now we are preparing to use the same method to understand the mechanism of hepatocyte damage in the liver.