G蛋白によるムスカリン性カリウムチャネルの活性化の機能的解析

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1.モルモット単一心房筋細胞でinside-out PatchClampを行い、細胞外膜側のアセチルコリンの濃度を一定(5μM)にして細胞内膜側のGTP濃度を変化させ、活性化G蛋白質量を変えた時のムスカリン性カリウム(K_<ACh>)チャネルのPatch電流を記録した。GTP濃度と活性化G蛋白質量は比例すると仮定した。2.各GTP濃度のデータに対し高速フーリエ変換を行いパワースペクトラムを加算平均しLorentzian Curveでfittingを行った。Power Spectrumは2つのLorentzian Curveの和でfittingできた。GTPの濃度を変化させても2つのCorner Frequencyに有意な変化はなかった。3.K_<ACh>チャネルのKineticsはClose(2) Close(1) Openの速いGatingとUnavailable Availableの遅いTransitionの2つの独立したTransitionからなると考えられた。4.Close(2) Close(1) Openの速いGatingの各Rate ConstantはGTPの濃度を変えても有意な変化はないが、一方Unavailable Availableの遅いTransitionのRate ConstantはGTPの濃度を上げると有意に変化した。細胞内GTP濃度とK_<ACh>チャネル活性の濃度活性曲線のHill係数は2.6で正の協同性が認められた。5.Monodらのアロステリック理論モデルを用いて濃度活性曲線のfittingを行ない、チャネルサブユニットの数が4個以上の時に良好にfittingできた。6.以上よりClose(2) Close(1) Openの間の反応は細胞内GTP濃度とは独立しており、GTPはUnavailable Availableの間の反応の平衡を変化させることにより開口確率を上昇させると考えられた。G蛋白質によるK_<ACh>チャネルの活性化過程は、アロステリック理論モデルでうまく説明できた。