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脳虚血における神経再生に関する基礎的研究

脑缺血神经再生的基础研究

基本信息

批准号：
08771091
负责人：
古屋一英
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Teikyo University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

ハロセン吸入麻酔下に10週齢雄性S-Dラットの左中大脳動脈を閉塞し、6時間、24時間、48時間、96時間目に潅流断頭し、パラフィン包埋し、5μmの切片を作成し、予備実験で確認された海馬を含むスライスを用いGAP-43メッセンジャーRNAの発現を確認するためin situ RT-PCR(reverse transcriptase polymerase chain reaction)を行った。シグナルの検出はラジオアイソトープを用いないdigoxigeninをhaptenとしたアルカリフォスファターゼによる発色を利用した。当初の実験では、非特異的シグナルの増強が強く、まずこれを除去する至適条件の設定に時間を費やした。親水処理後、塩酸処理による塩基性タンパクの除去、parafolmaldehydeによる後固定により組織を安定化し、グリシン処理により荷電を中和することで、非特異的シグナルは有意に減少したが、今度は目的とするメッセンジャーRNAの発現を見ないため、一部の報告で発現が確認されているbcl-2及びp53の発現も同様に調べたがシグナルを得られなかった。従って、「梗塞巣周囲の神経細胞にGAP-43メッセンジャーRNAが発現している」とする作業仮説を否定することはできず、現在その原因を探究中である。原因としては、(1)プライマーが不適切である(2)組織に作用される蛋白分解酵素proteinase Kの濃度が不適切である、ということが考えられる。(1)については一般的に何種類ものプライマーを用いても成功するのはごく一部である、という現時点での方法論的な限界と(2)については対象となる組織によってproteinase Kの至適濃度が大幅に異なる、という事実に基づいている。今後は複数のプライマーを用い、proteinase Kの濃度を変化させてシグナルを検出したいと考えている。

At 10 weeks of inhalation, male S-D segments were cut off at 6, 24, 48, and 96 hours, and 5μm sections were prepared to confirm the presence of RNA in the hippocampus using GAP-43. RT-PCR(reverse transcriptase chain reaction) was performed. The use of digoxigenin in the development of the disease At the beginning, the increase of non-specific parameters and the time spent on setting the appropriate conditions were reduced. After hydrophilic treatment, acid treatment, basic protein removal, paraformaldehyde fixation, tissue stabilization, chemical treatment, charge neutralization, non-specific protein reduction, current purpose, RNA generation, A partial report was found to confirm that bcl-2 and p53 were found in the same way. "GAP-43 mRNA expression in infarcted peripheral nerve cells" is an important part of the study. The reason is: (1) The concentration of protease K in tissue is not appropriate. (1)(2) In the case of tissue samples, the optimal concentration of proteinase K varies greatly from one sample to another. In the future, the concentration of protease K will be changed.