抗癌剤に誘導されるp53依存性および非依存性アポトーシス関連遺伝子の単離同定

(1)培養細胞株においての抗癌剤によるアポトーシスの誘導遺伝子変異部位が同定されているp53を発現している2つの培養細胞株(扁平上皮癌、骨肉腫)に抗癌剤を投与しアポトーシスを誘導させた。アポトーシスは抽出したDNAのアガロースゲル電気泳動法およびTunel法にて断片化を検出し、確認した。またp53発現のない細胞にカルシウム共沈法によりCMVプロモーター下変異p53発現ベクターを構築後導入し発現させ、同様に抗癌剤によるアポトーシスを誘導させた。(2)抗癌剤投与後の細胞株でのp53、p21およびc-myc遺伝子の発現の検討(1)の各培養細胞のアポトーシス誘導過程において、アポトーシス誘導シグナルに関連すると予想されているp53、p21およびc-myc、各々に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法によりmRNAの発現を検出した。その結果アポトーシス誘導前後においてこれらの発現量に顕著な差は認められなかった。(3)各細胞株でのアポトーシス誘導過程での特異的mRNAの単離、同定(1)の各培養細胞のアポトーシス誘導過程において、それぞれmRNAを抽出し、RT-PCR法にて増幅後、ディファレンシャル・ディスプレー法にてアポトーシス誘導細胞由来の特異的cDNAを単離した。その結果扁平上皮癌細胞株では12クローン、骨肉腫細胞株では8クローン得られた。現在、これらに共通のクローンが含まれているか、さらに既知遺伝子もしくはそれにホモロジーを持つものがあるかについて検索中である。またp53発現ベクター導入前後の細胞についても同様にしてp53非依存型および依存型アポトーシス特異的cDNAクローンを検索中である。

(1)培養細胞株においての抗癌剤によるアポトーシスの誘導遺伝子変異部位が同定されているp53を発現している2つの培養細胞株(扁平上皮癌、骨肉腫)に抗癌剤を投与しアポトーシスを誘導させた。アポトーシスは抽出したDNAのアガロースゲル電気泳動法およびTunel法にて断片化を検出し、確認した。またp53発現のない細胞にカルシウム共沈法によりCMVプロモーター下変異p53発現ベクターを構築後導入し発現させ、同様に抗癌剤によるアポトーシスを誘導させた。(2)抗癌剤投与後の細胞株でのp53、p21およびc-myc遺伝子の発現の検討(1)の各培養細胞のアポトーシス誘導過程において、アポトーシス誘導シグナルに関連すると予想されているp53、p21およびc-myc、各々に特異的なプライマーを用いたRT-PCR法によりmRNAの発現を検出した。その結果アポトーシス誘導前後においてこれらの発現量に顕著な差は認められなかった。(3)各細胞株でのアポトーシス誘導過程での特異的mRNAの単離、同定(1)の各培養細胞のアポトーシス誘導過程において、それぞれmRNAを抽出し、RT-PCR法にて増幅後、ディファレンシャル・ディスプレー法にてアポトーシス誘導細胞由来の特異的cDNAを単離した。その結果扁平上皮癌細胞株では12クローン、骨肉腫細胞株では8クローン得られた。現在、これらに共通のクローンが含まれているか、さらに既知遺伝子もしくはそれにホモロジーを持つものがあるかについて検索中である。またp53発現ベクター導入前後の細胞についても同様にしてp53非依存型および依存型アポトーシス特異的cDNAクローンを検索中である。