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化学修飾酵素メチルトリプシンを用いたペプチド合成

使用化学修饰酶甲基胰蛋白酶合成肽

基本信息

批准号：
08772030
负责人：
伊藤邦彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

トリプシン様酵素に特異的な逆性基質(p-グアニジノフェニルエステル)の、任意のアシル基を酵素活性中心内に導入できる性質を利用したペプチド合成法の開発の目的で、(1)逆性基質の合成及びトリプシン活性の測定、(2)トリプシン触媒ペプチド合成への応用、(3)化学修飾酵素メチルトリプシンによる縮合反応の試みについて検討を行なった。Boc-アミノ酸、オリゴペプチドをアシル基にもつ逆性基質を、1-[N,N'-Bis(Z)]amidinopyrazoleによるグアニジノ化を経る簡便合成法により合成した。速度論的解析より、いずれもトリプシンに良好な基質であった。トリプシン触媒による逆性基質とAla-pNAとの縮合反応を、50%DMSO-H_2O混合溶媒中で行なったところ、トリプシンの基質特異性に拘らずペプチドを生成した。さらに、非天然アミノ酸であるα,α-二置換アミノ酸の逆性基質を用いた場合も、効率良くペプチド縮合反応が進行することを示し、酵素法では初の非天然型アミノ酸含有ペプチドの合成を達成した。修飾酵素メチルトリプシンのペプチド合成への応用性を検討した。トリプシンの活性中心His-57のイミダゾリル基を、修飾試薬により選択的にメチル化し、アフィニティークロマトグラフィーで精製した。得られた修飾酵素の基質親和性は通常型トリプシンと同程度であったが、アミダーゼ活性はほぼ消失し、エステラーゼ活性も未修飾トリプシンの0.05%程度であった。未修飾トリプシンと同条件でペプチド合成に用いたところ、縮合反応は進行するものの反応速度は遅く、副反応である基質の加水分解がペプチド縮合反応に優先する傾向が見られた。今後、反応条件の再検討を進める予定である。

Tereto enzyme and specific reverse matrix (p-グアニジノフェニルエステル)の、arbitrary The purpose of introducing the できるproperty into the active center of シル-based enzyme and utilizing the したペプチド synthesis method, (1 )Synthesis of reverse substrate and measurement of the activity of Totronic catalyst, (2) Synthesis of Totronic catalyst Use, (3) chemical modification enzyme メチルトリプシンによるcondensation reaction のTRI みについて検question を行なった. Boc-Aminic acid, オリゴペプチドをアシルbased にもつreverse matrixを, 1-[N,N'-Bis( Z)] Amidinopyrazole is a simple and easy synthesis method. Analysis of speed theory より, いずれもトリプシンにGood な matrix であった. Tereto Catalyst Reverse Matrix Ala-pNA Condensation Reaction Base, 50% DMSO-H_ In the 2O mixed solvent, the で行なったところ and the トリプシンの matrix-specific に氉ずペプチドをgenerated した.さらに, non-natural アミノ acid であるα, α-disubstituted アミノ acid のreversible matrix can be used in いた occasions, high efficiency くペプチThe condensation reaction is carried out and the enzymatic method is used to synthesize the non-natural amine acid containing ペプチドのsynthesis. Modification enzyme メチルトリプシンのペプチド synthesis への応utility を検した. Torotron active center His-57のイミダゾリルbase, modified test kitにメチル化し and アフィニティークロマトグラフィーでRefined した of the selected products. The substrate affinity of the modified enzyme is the same as that of the normal type of Toni-modified enzyme. Active はほぼdisappears, エステラーゼactive もUnmodified トリプシンの0.05% level であった. Unmodified トリプシンと same condition でペプチド synthetic にいたところ, condensation reaction は carry out するものののreaction Speed は遅く, secondary reaction である matrix の hydrolysis がペプチド condensation reaction に priority する tendency が见られた.今後、反応条件の再検討を進める予定である。