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修飾トリプシンを用いたペプチド合成法の開発

使用修饰胰蛋白酶的肽合成方法的开发

基本信息

批准号：
07772105
负责人：
伊藤邦彦
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Health Sciences University of Hokkaido
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、酵素触媒ペプチド合成における新手法の開発を目的として、トリプシンの活性中心に任意のアシル基を導入できるp-グアニジノフェニルエステル類、所謂逆性基質の性質を利用し、基質親和性を保持しつつ、プロテアーゼ活性を消失させた化学修飾酵素アンヒドロトリプシンニヨルペプチド合成を試みたものである。1、逆性基質として、Boc-アミノ酸p-グアニジノフェニルエステルをデザインした。従来、p-グアニジノフェニルエステル類は、グアニジノ基の強い塩基性のために合成が困難とされてきたが、p-アミノフェニルエステルのアミノ基の1-[N',N"-bis (Z) amidino]pyrazaleによるグアニジノ基への変換を経由する合成法を確立し、アシル基に種々ノBoc-アミノ酸やオリゴペプチドを有する逆性基質の合成に成功した。2、アンヒドロトリプシンは、既知の調整法に従い、ウシトリプシンの活性化中心にセリン残基をPMS化、続いてアルカリ処理シ、アフィニティークロマトグラフィーにより精製し、アミダーゼ活性がほぼ消失した標品を得た。3、得られた基質及び酵素を用いてペプチド縮合反応を行った。逆性基質、L-Ala-pNAを各々1mM、20mM用い、アンヒドロトリプシン存在下、20%DMSOを含む50mM-MOPS緩衝液(pH7.5)中で反応を行ない、HPLCにより定量した。逆性基質のアシル基がBoc-L-Tyr、Boc-L-Pheの場合、何れも80%以上の収率で反応が進行した。また、縮合の生成物の二次的加水分解は観測されなかったことがら、アンヒドロトリプシンは活性中心Ser-195の側鎖の水酸基が消失しているにも拘わらず、ペプチド縮合反応を効率的に触媒することを見い出した。今後、他のアシル基を有する逆性基質に対するアンヒドロトリプシンの触媒効果を検討し、生理活性ペプチドの合成への応用へ展開する予定である。

The purpose of this study is to develop a new method for enzyme selection and synthesis, to introduce any functional group into the active center of the enzyme, to utilize the properties of the so-called inverse matrix, to maintain the affinity of the matrix, to eliminate the activity of the enzyme, and to modify the enzyme selection and synthesis. 1. Reverse matrix: Boc-4 - 5 - 6- The synthesis of 1-[N', N"-bis (Z) amidino]pyrazale from the strong neutral base of the p-amino group was successfully established by the synthesis method of the strong neutral base of the p-amino group. 2. The activation center of the protein is modified by known methods, and the protein is purified by modified methods. 3. The substrate and enzyme are used in the condensation reaction. Reverse matrix, L-Ala-pNA at 1mM, 20mM, and in the presence of reverse matrix, 20% DMSO, and 50 mM MOPS buffer (pH 7.5). When the reverse matrix is Boc-L-Tyr or Boc-L-Phe, the reverse matrix can be obtained at a rate of more than 80%. The secondary hydrolysis of the condensation products was investigated by means of a catalyst for the removal of the active site Ser-195 from the aqueous acid group. In the future, there will be a study on the catalytic effect of different kinds of substrates, and a predetermined development of physiological activity and synthesis.