FoF_1-ATP合成酵素の高次構造の解析

FoF_1-ATP合酶高阶结构分析

基本信息

批准号：
08780560
负责人：
表弘志
金额：
$ 0.7万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780560/
关键词：
ATP Synthase FoF_1

项目摘要

本研究では、FoF_1-ATP合成酵素の立体構造を明らかにするため、FoF_1および、Foの精製、2次元結晶化条件の検索を行った。また、脂質二重膜に再構成した精製酵素をAFM(原子間力顕微鏡)で表面観察した。これによって、膜内在性であるFoのサブユニットの配置に関する情報を得ることができた。FoF_1-ATP合成酵素は、我々が既に報告している大量発現系を用いて、密度勾配遠心により精製した。また、Foは精製FoF_1を尿素で処理した。この処理でF_1部分のサブユニットを解離させ、その後Fo部分を遠心操作により沈殿させた。これにより、精製度90%以上のFoを得ることができた。このようにして調製したFo及びFoF_1を脂質二重膜に再構成し、AFMによる観察、二次元結晶化の条件の検索に用いた。Foは膜内在性で、H^+の輸送部位を形成している。したがって、H^+輸送の機構を理解するためにはFoの構造を明らかにすることが必要である。これまでにa,b,cの3種のサブユニットから構成されていること、これらのサブユニットが1:2:10-12の量比で存在していることが報告されている。しかし、これらのサブユニットの配置がどうなっているかはまだ明らかでなかった。本研究ではAFMを用いて、Foの表面構造を観察することにより、Foの各サブユニットの配置を推定した。その結果、cサブユニットによる、リング状の構造物とa,bサブユニットからなると思われる膨らみを見いだした。これは、cサブユニットが形成するリングの外側にaとbサブユニットが配置していることを示している。

在这项研究中，为了阐明FOF_1-ATP合酶的三维结构，我们搜索了FOF_1和FO的纯化以及二维结晶条件。此外，使用AFM（原子力显微镜）在表面观察到在脂质双层中重构的纯化酶。这使我们能够获取有关Endo-Mmbrane积分的FO亚基的放置的信息。通过使用我们已经报告的大量表达系统，通过密度梯度离心纯化FOF_1-ATP合酶。此外，用尿素处理纯化的FOF_1。该处理分离了F_1部分的亚基，然后通过离心沉淀FO部分。这允许具有90％或以上的纯化程度的FO。将这样制备的FO和FOF_1重组为脂质双层膜，并用于AFM观察，并寻找二维结晶的条件。 FO是内质的，形成了H^+的运输部位。因此，有必要阐明FO的结构，以了解H^+运输的机制。到目前为止，据报道它由三个亚基A，B和C组成，并且这些亚基的数量比为1：2：10-12。但是，目前尚不清楚这些亚基的布置是什么。在这项研究中，我们通过使用AFM观察FO的表面结构来估算每个FO的每个亚基的布置。结果，我们发现了一个凸起，该凸起似乎由C亚基组成的环状结构和A和B亚基组成。这表明A和B亚基位于C亚基形成的环外。