大腸菌F_OF_1-ATP合成酵素の結晶化と立体構造の解析

本研究では、FoF_1-ATP合成酵素の立体構造を明らかにするため、FoF_1および、F_1の精製、及び予備的な結晶化条件の検索を行った。FoF_1-ATP合成酵素は、我々が既に報告している大量発現系を用いて、密度勾配遠心法により精製した。また、F_1は同じ発現系を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製した。このようにして調製したFoF_1を脂質二重膜に再構成し、AFMによる観察、二次元結晶化の条件の検索に用いた。また、F_1を用いて、蒸気拡散法による三次元結晶化を試みた。Foは膜内在性で、H^+の輸送部位を形成している。したがって、H^+輸送の機構を理解するためにはFoの構造を明らかにすることが必要である。これまでにa,b,cの3種のサブユニットから構成されていることが報告されている。しかし、これらのサブユニットの配置がどうなっているかはまだ明らかでなかった。本研究ではAFMを用いて、Foの表面構造を観察することにより、Foの各サブユニットの配置を推定した。また、F_1の3次元結晶化条件の予備的な検討を行い、基礎的なデー夕を得た。さらにFoのcサブユニットにCysを導入し、低温電子顕微鏡で観察する系を構築した。

本研究では、FoF_1-ATP合成酵素の立体構造を明らかにするため、FoF_1および、F_1の精製、及び予備的な結晶化条件の検索を行った。FoF_1-ATP合成酵素は、我々が既に報告している大量発現系を用いて、密度勾配遠心法により精製した。また、F_1は同じ発現系を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製した。このようにして調製したFoF_1を脂質二重膜に再構成し、AFMによる観察、二次元結晶化の条件の検索に用いた。また、F_1を用いて、蒸気拡散法による三次元結晶化を試みた。Foは膜内在性で、H^+の輸送部位を形成している。したがって、H^+輸送の機構を理解するためにはFoの構造を明らかにすることが必要である。これまでにa,b,cの3種のサブユニットから構成されていることが報告されている。しかし、これらのサブユニットの配置がどうなっているかはまだ明らかでなかった。本研究ではAFMを用いて、Foの表面構造を観察することにより、Foの各サブユニットの配置を推定した。また、F_1の3次元結晶化条件の予備的な検討を行い、基礎的なデー夕を得た。さらにFoのcサブユニットにCysを導入し、低温電子顕微鏡で観察する系を構築した。