大腸菌F_OF_1-ATP合成酵素の結晶化と立体構造の解析

大肠杆菌F_OF_1-ATP合酶的结晶及三维结构分析

• 批准号: 09780546
• 负责人: 表 弘志
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780546/
• 关键词: ATPwe; 結晶化; ATPase

本研究では、FoF_1-ATP合成酵素の立体構造を明らかにするため、FoF_1および、F_1の精製、及び予備的な結晶化条件の検索を行った。FoF_1-ATP合成酵素は、我々が既に報告している大量発現系を用いて、密度勾配遠心法により精製した。また、F_1は同じ発現系を用いて、カラムクロマトグラフィーにより精製した。このようにして調製したFoF_1を脂質二重膜に再構成し、AFMによる観察、二次元結晶化の条件の検索に用いた。また、F_1を用いて、蒸気拡散法による三次元結晶化を試みた。Foは膜内在性で、H^+の輸送部位を形成している。したがって、H^+輸送の機構を理解するためにはFoの構造を明らかにすることが必要である。これまでにa,b,cの3種のサブユニットから構成されていることが報告されている。しかし、これらのサブユニットの配置がどうなっているかはまだ明らかでなかった。本研究ではAFMを用いて、Foの表面構造を観察することにより、Foの各サブユニットの配置を推定した。また、F_1の3次元結晶化条件の予備的な検討を行い、基礎的なデー夕を得た。さらにFoのcサブユニットにCysを導入し、低温電子顕微鏡で観察する系を構築した。

In this study, we investigated the structure, purification and crystallization conditions of F_1-ATP synthase. FoF_1-ATP synthase is reported to be highly efficient in the production of protein and protein, and is refined by density matching. F_1 is the same as the development system. This is the case for modulation of FOF_1 lipid bilayer membrane reconstruction, AFM observation, and investigation of conditions for secondary crystallization. The three-dimensional crystallization was studied by the method of evaporation and diffusion. Fo film intrinsic property, H^+ transport site formation. To understand the structure of H^+ transport A,B,C are three kinds of reports.しかし、これらのサブユニットの配置がどうなっているかはまだ明らかでなかった。In this study, AFM was used to investigate the surface structure of Fo, and the configuration of Fo was estimated. A preliminary study of the conditions for F_1 and 3D crystallization was carried out and the basic conditions were obtained. Cys was introduced into the system and observed by a cryogenic electron microscope.

项目成果

Omote,H.: "Mutational analysis of F_1F_OATPase: Catalysis and energy coupling." Acta Physiol Scand Suppl. 643. 177-183 (1998)

Omote,H.：“F_1F_OATPase 的突变分析：催化和能量耦合。”

Omote,H.: "A Key region for H^+-ATP synthase(H^+-ATPase)stability:B subunit loop (Asp301〜Asp305)and r subunit Gln-269" Arohives of Biochemistry and Biophysics. 358. 277-282 (1998)

Omote，H.：“H^+-ATP 合酶（H^+-ATPase）稳定性的关键区域：B 亚基环（Asp301〜Asp305）和 r 亚基 Gln-269”Arohives 生物化学和生物物理学 358。277-。 282 (1998)

Yoshimizu,T.: "Essential Cys-Pro-Cys mofif of Caenorhabdiris elegans copper transport ATPase" Biosci Biotechnol Biochem. 62. 1258-1260 (1998)

Yoshimizu,T.：“秀丽隐杆线虫铜转运 ATP 酶的必需 Cys-Pro-Cys mofif”Biosci Biotechnol Biochem。

Takeyasu, K.: "Atomic force microscopy of Esherichia coli F_0F_1-ATPase in reconstituted membranes" Ann. NY Acad. Sci.3・834. 149-152 (1997)

Takeyasu, K.：“重组膜中大肠杆菌 F_0F_1-ATP 酶的原子力显微镜”，Ann. NY Acad. 149-152 (1997)。