酸素存在下でも窒素酸化物を除去できるスーパー細菌の育種と環境浄化

培育即使有氧也能去除氮氧化物的超级细菌并净化环境

基本信息

批准号：
09750874
负责人：
三宅克英
金额：
$ 1.6万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

前年度までにParacoccus denitrificans脱窒系酵素遺伝子群の構造が明らかになったので、本年度はその機能及び発現の解析を進めた。まず機能未知のORF1,2についてその機能解析を行った。それぞれpGEX-5X-2ベクターにGST融合蛋白となるように連結し、発現を調べた。その結果、ORF2は安定に大腸菌内で融合蛋白として発現できることが判明したが、一方でORF1は封入体としてしか生産されなかった。この蛋白がもつ膜貫通モチーフや、シグナル様配列がこの原因であると考え、これらの部分を欠いたものを構築して発現を試みたが、いずれもやはり封入体を形成した。発現されたORF2についてゲルリターデーション法で機能を解析したところORF2はDNAには結合しないということが判明した。使用したDNAはnir遺伝子群、nor遺伝子群の上流約100bpの断片である。DNA結合モチーフを有するORF1に関しては、封入体を作りにくいマンノース結合蛋白融合蛋白としての発現を考えており、タンパク質が発現できればゲルリターデーション実験を行うことを予定している。一方、発現制御に関しては、ノーザンハイブリダイゼーション及びRT-PCRを行った結果、オペロン全体の転写産物はnir,norとも嫌気条件でのみ起こることがわかった。しかしながら好気条件下でも窒素酸化物存在下では、短い転写産物がみられており、このことは窒素酸化物による発現制御の存在を示唆するものであった。

去硝化酶基因组的denitrificans denitrificans的结构已揭示到上一年，因此今年我们继续分析其功能和表达。首先，我们分析了ORF 1和2的功能，这些功能的功能未知。通过将PGEX-5X-2载体连接到GST融合蛋白中来检查表达，并检查了表达。结果表明，ORF2可以稳定地表示为大肠杆菌中的融合蛋白，而ORF1仅作为包容体产生。该蛋白质被认为是原因的原因，并且使用跨膜基序和信号样序列来构建和表达它，这些蛋白缺乏这些部分，但两者都形成包容体。当使用凝胶延迟分析表达的ORF2的功能时，发现ORF2没有与DNA结合。使用的DNA是NIR和非基因组上游约100 bp的片段。关于具有DNA结合基序的ORF1，我们将表达视为甘露糖结合蛋白融合蛋白，难以形成包含体，并且如果可以表达蛋白质，我们计划进行凝胶延迟实验。另一方面，在表达控制方面，北部杂交和RT-PCR表明，整个操纵子的转录本仅在NIR和NOR中发生在厌氧条件下。然而，即使在有氧条件下，在存在氮氧化物的情况下也观察到短期转录本，这表明存在氮氧化物调节。