酸素存在下でも窒素酸化物を除去できるスーパー細菌の育種と環境浄化

前年度までにParacoccus denitrificans脱窒系酵素遺伝子群の構造が明らかになったので、本年度はその機能及び発現の解析を進めた。まず機能未知のORF1,2についてその機能解析を行った。それぞれpGEX-5X-2ベクターにGST融合蛋白となるように連結し、発現を調べた。その結果、ORF2は安定に大腸菌内で融合蛋白として発現できることが判明したが、一方でORF1は封入体としてしか生産されなかった。この蛋白がもつ膜貫通モチーフや、シグナル様配列がこの原因であると考え、これらの部分を欠いたものを構築して発現を試みたが、いずれもやはり封入体を形成した。発現されたORF2についてゲルリターデーション法で機能を解析したところORF2はDNAには結合しないということが判明した。使用したDNAはnir遺伝子群、nor遺伝子群の上流約100bpの断片である。DNA結合モチーフを有するORF1に関しては、封入体を作りにくいマンノース結合蛋白融合蛋白としての発現を考えており、タンパク質が発現できればゲルリターデーション実験を行うことを予定している。一方、発現制御に関しては、ノーザンハイブリダイゼーション及びRT-PCRを行った結果、オペロン全体の転写産物はnir,norとも嫌気条件でのみ起こることがわかった。しかしながら好気条件下でも窒素酸化物存在下では、短い転写産物がみられており、このことは窒素酸化物による発現制御の存在を示唆するものであった。

前年度までにParacoccus denitrificans脱窒系酵素遺伝子群の構造が明らかになったので、本年度はその機能及び発現の解析を進めた。まず機能未知のORF1,2についてその機能解析を行った。それぞれpGEX-5X-2ベクターにGST融合蛋白となるように連結し、発現を調べた。その結果、ORF2は安定に大腸菌内で融合蛋白として発現できることが判明したが、一方でORF1は封入体としてしか生産されなかった。この蛋白がもつ膜貫通モチーフや、シグナル様配列がこの原因であると考え、これらの部分を欠いたものを構築して発現を試みたが、いずれもやはり封入体を形成した。発現されたORF2についてゲルリターデーション法で機能を解析したところORF2はDNAには結合しないということが判明した。使用したDNAはnir遺伝子群、nor遺伝子群の上流約100bpの断片である。DNA結合モチーフを有するORF1に関しては、封入体を作りにくいマンノース結合蛋白融合蛋白としての発現を考えており、タンパク質が発現できればゲルリターデーション実験を行うことを予定している。一方、発現制御に関しては、ノーザンハイブリダイゼーション及びRT-PCRを行った結果、オペロン全体の転写産物はnir,norとも嫌気条件でのみ起こることがわかった。しかしながら好気条件下でも窒素酸化物存在下では、短い転写産物がみられており、このことは窒素酸化物による発現制御の存在を示唆するものであった。