精巣機能を制御する新しい細胞外マトリックスタンパクの検索,二次元電気泳動を用いたタンパクの分離・同定

寻找控制睾丸功能的新细胞外基质蛋白，利用二维电泳分离和鉴定蛋白质

• 批准号: 09770013
• 负责人: 矢間 太
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770013/
• 关键词: ラット; 精巣; 細胞外マトリックス; IV型コラーゲン; 二次元電気泳動; アミノ酸シークエンス

ラット精細管細胞外マトリックス(以下ST-ECM)成分を生化学的に分析し、ここから新しいECM成分を同定し、これが精巣機能にどの様な影響を及ぼすのかを解明するために実験を進めている。現在私たちはST-ECMを単離し、この8モル尿素溶液可溶化分画を二次元電気泳動によって、分子量2〜20万の範囲で20以上のECM成分に分離している。この内分子量約18万、pl5.0のタンパクを回収し、アミノ酸シークエンスを行なった結果、このタンパクがIV型コラーゲンα5鎖(ヒト)とホモロジーがあることを確認した。一方私たちは精細管基底層(testicular lamina propria)のECM構成層を5層であると定義し、今までには存在が確認されていなかったECM成分の確認、今までに報告されていた局在パタンとの相違を免疫電子顕微鏡法によって明らかにし、これを報告した。さらに、ST-ECMをマウスに免疫し、これより数種のモノクローナル抗体を得た。蛍光抗体法によってST-ECMのみを特異的に認識する抗体をスクリーニングした。このうちの1つである13H12抗体はWestern blottingによっても精巣特異的であることが確認され、ST-ECMの8モル尿素溶液可溶化分画の27-kDタンパクを認識することを確認した。SDS-PAGEによって27-kDタンパクを分離し、ゲル切り出しによって回収・濃縮した。次いで27-kDタンパクをCleveland法に従ってV8 protease digestionを行なった後に、PVDF膜に転写した。得られた数本のV8 digested 27-kDタンパクフラグメントについてアミノ酸シークエンス分析を行なった結果、Hypothetical protein 23.2-kD(EMBL accession No.006392)とHypothetical protein 24.2-kD(EMBL accession No.Q50509)にそれぞれ36.842%、46.145%のhomologyを示した。この結果より、27-kDタンパクは新規のECMタンパクであることが強く示唆され、このアミノ酸シークエンス分析のデータを手がかりに、遺伝子工学的な解析に着手する予定である。

Biochemical analysis of extracellular components of fine tubule (hereinafter referred to as ST-ECM), identification of new ECM components, influence of sperm function, and understanding of the effects of different ECM components. Now, ST-ECM is isolated from 8 kinds of urea solution, and ECM components with molecular weight of 2 ~ 200,000 and above are isolated. The internal molecular weight of this compound is about 180,000, pl5.0, and it is confirmed that it has a high molecular weight and a high molecular weight. The ECM component layer of a single layer of testicle lamina propria is defined in five layers, and the presence of ECM components is confirmed. The ECM component is confirmed and reported in five layers of testicle lamina propria. In addition, ST-ECM can be used to detect the immune system. The light antibody method is used to identify ST-ECM and its specific antibody. The 13H12 antibody is specific to Western blotting and is recognized as a 27-kD antibody soluble in ST-ECM 8-urea solution. SDS-PAGE was used to isolate and concentrate 27-kD proteins. The 27-kD membrane was prepared by the Cleveland method using V8 protease digestion. The V8 digested 27-kD(EMBL accession No.006392) Hypothetical protein 24.2-kD (EMBL accession No.Q50509) was 36.842% and 46.145% respectively. The results show that the 27-kD model can be used to analyze new ECM models, and the analysis of genetic engineering can be carried out in a predetermined way.

项目成果

K.Kadonosono,N.Itoh,F.Yazama et al.: "Effect of intracameral anesthesia on the corneal endothelium" J.Cataract Refract Surg. Vol.24. 1377-1381 (1998)

K.Kadonosono、N.Itoh、F.Yazama 等人：“前房内麻醉对角膜内皮的影响”J.Cataract Refract Surg。

F.Yazama et al.: "Immunocytochemistry of extracellular matrix components in the rat seminiferous tubule" Anatomical Record. Vol.248. 51-62 (1997)

F.Yazama 等人：“大鼠生精小管细胞外基质成分的免疫细胞化学”解剖记录。