精巣機能を制御する新しい細胞外マトリックスタンパクの検索

寻找控制睾丸功能的新细胞外基质蛋白

• 批准号: 07770013
• 负责人: 矢間 太
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Yokohama City University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07770013/
• 关键词: ラット; 精巣; 細胞外マトリックス; IV型コラーゲン; ラミニン; モノクローナル抗体; SDS-PAGE; ウエスタンブロッティング

私たちは、ラット精細管細胞外マトリックス(ECM)成分を抗原に用い、マウスに免疫して幾つかのモノクローナル抗体を作成した。これらの抗体の中で精巣特異性を示すものが存在しているかを、ラット8組織(精巣・肺・肝臓・小腸・心筋・骨格筋・腎臓・脳)において蛍光抗体法を用いてスクリーニングを行った結果、12G11と言う抗体が精巣特異性を示した。この抗体を用いて凍結超薄切片法による免疫電顕を行なった結果、12G11の抗原タンパクは精細管基底膜と、筋様細胞の基底膜に局在していることが確認された。生化学的にも12G11のの精巣特異性を確認するために、同様の8種類の組織からECM成分をそれぞれ単離し、これを8モル尿素、2%メルカプトエタノールで可溶化し、この可溶化分画をアガロース電気泳動法によって分離し、次いで電気泳動的にタンパクをニトロセルロース膜に転写させ、12G11と反応させた。この結果から、生化学的にも12G11の精巣特異性が示された。アガロース電気泳動法において12G11が認識するバンドをアガロースゲルを直接切り出すことによって回収し、これを5%SDS-PAGEで分析した結果、このバンドには210、200、185および175-kDのタンパクが含まれていることが確認された。これらのバンドが分子量の大きい方からラミニンのB1・B2鎖、IV型コラーゲンのα1(IV)・α2(IV)鎖であることをウエスタンブロッティングで確認した。12G11はこれらのどのバンドにも反応を示さず、フロント部分に反応が認められたので、12G11の抗原タンパクの分子量を推定するために10%SDS-PAGE、ウエスタンブロッティングを行なった。この結果から、12G11の抗原は27-kDであることが推定された。以上の結果から、12G11が認識しているタンパクは、ラミニンやIV型コラーゲンと挙動を供にすること、今までには報告のない低分子量の精巣特異的なECMタンパクであることが示唆された。私たちは今、27-kDタンパクが単一タンパクであることを証明するために、ラット精巣ECM成分の二次元電気泳動法の確立に努力している。糖タンパクを含むECM成分の二次元電気泳動はその条件設定に予想以上の困難を強いられているが、二次元電気泳動法が確立出来れば、12G11が認識する27-kDタンパクの解析が完結すると考えている。

Antigen preparation for extracellular matrix (ECM) components, immune matrix preparation for antibodies The specificity of sperm in these antibodies was demonstrated by the results of the light antibody method in 8 tissues (sperm, lung, liver, small intestine, heart muscle, bone muscle, kidney). The specificity of sperm in these antibodies was demonstrated by 12G11. The results of immunoelectrophotography using frozen ultra-thin sections of the antibody showed that 12G11 antigen was present in the basement membrane of fine tubule and tendon cells. Biochemically, the sperm specificity of 12G11 was confirmed by eight different tissue types, including ECM components, such as urea, 2% urea, solubilization, solubilization, and electrophoresis. The results showed that the sperm specificity of 12G11 in biochemistry was higher than that in control group. The results of the analysis by 5% SDS-PAGE were confirmed by the direct cut of the 12G11-based electrophoresis method. The 210, 200, 185, and 175-kD samples were included. The B1·B2 lock of the type IV is identified by the α1(IV)·α2(IV) lock of the type IV. 12G11 antigen molecular weight was estimated by 10% SDS-PAGE and 10% SDS-PAGE. 12G11 antigen is 27-kD. The above results show that 12G11 has a low molecular weight and specific ECM. The 27-kD electrokinetic method for the determination of ECM components was established. The second dimension electrokinetic method with ECM component was established. The analysis of 12G11 was completed.