β-lactoglobulin抗原に対するミルクアレルギー患者T細胞応答の解析

牛奶过敏患者对β-乳球蛋白抗原的T细胞反应分析

• 批准号: 09770539
• 负责人: 伊上 良輔
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09770539/
• 关键词: ミルクアレルギー; 抗原; β-lactoglobulin; T細胞; HLA; クラスII; エピトープ; β-lactoglibolin

1) β-lactoglobilin ペプチドの合成:β-lactoglobilinのアミノ酸配列に従い、オーバーラッピングペプチドを合成した.合成は,Fmoc-strategyに基づきシステムPSSM-8(Shimazu)によって施行した。2) HLAタイピング:HLAクラスII(DR,DO,DP)対立遺伝子のタイピングは第11回International Histocompatibility Workshopにおいて施行された方法に基づき.PCR.SSOP法によって行った.3) 抗原特異的T細胞株の樹立: ミルクアレルギー患者より末梢血単咳球(PBMC)を分離しβ-lactoglobilin坑原と共にこ96穴プレートて培養した.β-lactoglobilinペプチド混合物でパルスした自己のPBMCをfeederとしてrhIL-2(50U/ml)とrhIL-4(10U/ml)を7日毎に加え4株のβ-lactoglobilin 特異的T細胞株を得た.抗原特異的T細砲株からTerasakiプレートを用いた限界希釈法によりクローン化を行いβ-lactoglobilin特異的T細胞クローンCY2.7とSM4.6を樹立した.4) 抗原特異的T細胞により認識されるT細胞エピトーブの解析: T細胞の抗原特異的増殖反応は培養72時問後の[^3H]TdRの取り込みにより定★した.β-lactoglobilin 特異的T細胞株に関して合計7つペプチド上にT細胞エピトーブが認められたが,各細胞株が認識認するエピトーブはそれぞれ異なるパターンを示した.IR line はp142-162のみ、AH lineは p14-29,p47-67,p77-97,p97-117を,TK lineはp1-21,p47-67を,MT lineはp1-21,p30-47,p97-117を認識していた.このうちp1-21,p47-67,p97-117の3つのペプチドは異なるタイプのHLAクラスH分子に拘束された複数のT細胞によって認識された.T細胞クローンIR1.9はp142-162を認識していた.MT2.9はp97-117を認識し,このうちp101-115が抗原決定基と考えられた.5) 抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を用いた抗原提示分子の検討: 抗原特異的T細胞株およびクローンの抗原堤示分子を同定するために,抗HLAクラスIIモノクローナル抗体を培養系に添加してT細胞応答への影響を調べた.T細胞株では4株のうち3株で抗DR抗体により著明な増殖阻止反応が認められ,1株では抗DQ抗体によって増殖の阻止が認められた.T細胞クローンでは2クローン共に抗DR抗体により増殖阻止が認められた.β-lactoglobilin の抗原提示にはDR分子の関与が強く示された.6) T細胞受容体の遺伝子解析: 樹立した抗原特異的T細胞のRNAからcDNAを合成し、RT-PCR法によりT細胞受容体(Vα,Vβ,Jα,Jβ)の解析を行った.ペプチド142-162を認織するIR1.9はVα5 Vβ13.1,Jα11 Jβ1.4を,ペプチド97-117を認識するMT2.9はVα8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7を有していた.7) T細胞によるサイトカイン産生の検討: IR line,AH line,MT lineに関してELISA法によりサイトカイン(IL-4,IL-5,IFN-γ)産生の検討を行った.3株共に大量のIL-5を産生していた.臨床的に即時型の症状を呈したAH line はIL-4の産生が優位であり,非即時型の症状を呈したIR lineはIFN-γの産生が優位であった.

1)Synthesis of β-lactobilin:β-lactobilin is prepared from the acid sequence of β-lactobilin, and the acid sequence of β-lactobilin is prepared from β-lactobilin. The Fmoc-strategy strategy is based on PSSM-8(Shimazu). 2)HLA classification:HLA classification II(DR,DO,DP) for the identification of T cell lines. The 11th International Histocompatibility Workshop was conducted to develop the basic PCR.SSOP method. 3) Establishment of antigen-specific T cell lines: isolation of β-lactoglobulin from peripheral blood lymphocytes (PBMC) of patients. 4 β-lactoglobulin specific T cell lines were obtained by adding rhIL-2(50U/ml) and rhIL-4(10U/ml) to the mixture every 7 days. Antigen-specific T cell lines were identified by Terasaki assay. β-lactoglobulin specific T cell lines were identified by CY2.7 and SM4.6 assay. 4) Antigen-specific T cell lines were identified by T cell analysis. Antigen-specific T cell proliferation was detected by TdR assay after 72 hours of culture. A total of 7 β-lactobilin specific T cell lines were identified.IR line p142-162, AH line p14-29,p47-67,p77-97,p97-117,TK line p1-21,p47 - 67, MT line p1 - 21,p30-47, p97-117 Understanding. p1-21,p47-67,p97-117 and p142-162 -117 - 17 - 1 5) Anti-HLA anti-HLA anti-Antigen-specific T cell lines were identified by anti-HLA II antibody. The effect of anti-DR antibody on T cell response was modulated by adding anti-HLA II antibody to culture lines. Four T cell lines were identified by anti-DR antibody. 1 strain of anti-DQ antibody was used to inhibit proliferation. 2 strains of anti-DR antibody were used to inhibit proliferation of T cells. 6) T cell receptor analysis: RNA cDNA synthesis for T cell receptor (Vα,Vβ,Jα,Jβ) was performed by RT-PCR. IR1.9 Vα5 Vβ13.1,Jα11 Jβ1.4, MT2.9 Vα 8 V β 2 J α 130 J β 2.7 Select 142-162 to recognize MT2.9 Vα8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7 Select 142 - 162 to recognize MT2.9 Vα5 Vβ13.1,Jα11 Jβ1.4 to recognize MT2.9 Vα8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7 Select 142 - 162 to recognize MT2.9 V α 8 Vβ2 Jα130 Jβ2.7 to recognize MT2.9 V α 8 V β 2 J α 130 J β 2.7. IR line,AH line,MT line were used to detect IL-4,IL-5,IFN-γ production by ELISA. The AH line is superior to IL-4 production in clinical immediate symptoms, and the IR line is superior to IFN-γ production in non-immediate symptoms.

项目成果

Toshiyuki Fukao, Ryosuke Inoue,et al.: "Ataxia-telangiectasia in the Japanese population : Identification of R1917X,W2491R,R2909G,IVS33+2T→A,and 7883dc15,the latter two being relatively common mutations" Human mutation. 12. 338-343 (1998)

Toshiyuki Fukao、Ryosuke Inoue 等人：“日本人群中的共济失调毛细血管扩张症：R1917X、W2491R、R2909G、IVS33+2T→A 和 7883dc15 的鉴定，后两种是相对常见的突变”人类突变。 -343 (1998)

N.Kondo, R.Inoue,et al.: "DNasc I hypersensitive sites in human I_E region of immunoglobulin heavy chain genes abnormally induced by interleukin-4 in B-lymphocytes of atopic patients with high levels of serum IgE" Invest Allergol Clin Immunol. 8. 234-238

N.Kondo、R.Inoue 等人：“血清 IgE 水平高的特应性患者 B 淋巴细胞中白细胞介素 4 异常诱导人免疫球蛋白重链基因 I_E 区中的 DNAsc I 超敏位点”Invest Allergol Clin Immunol

Hideaki Tashita, Ryosuke Inoue,et al.: "Molecular basis of selective IgG2 deficiency." J.Clin.Invest.101. 677-681 (1998)

Hideaki Tashita、Ryosuke Inoue 等人：“选择性 IgG2 缺陷的分子基础。”

Naomi Kondo, Ryosuke Inoue, et al.: "Inhibition of interferon-γ production from lymphocytes stimulated with food antigens by a β_2-agonist,procaterol,in patients with food-sensitive atopic dermatitis." Journal of Investigational Allergology and Clinical I

Naomi Kondo、Ryosuke Inoue 等人：“在食物敏感的特应性皮炎患者中，通过 β_2 激动剂丙卡特罗刺激淋巴细胞，抑制干扰素 γ 的产生。”

Yukiji Yamada, Ryosuke Inoue,et al.: "Ataxia telangiectasia associated with B-cell lymphoma : the effect of half-dose of the drugs administered according to the acute lymphoblastic leukemia standard risk protocol" Pediatr Hematol Oncol.15. 425-429 (1998)

Yukiji Yamada、Ryosuke Inoue 等人：“与 B 细胞淋巴瘤相关的共济失调毛细血管扩张：根据急性淋巴细胞白血病标准风险方案服用半剂量药物的效果”Pediatr Hematol Oncol.15。