小児遺伝性無顆粒球症(コストマン症候群)におけるG-CSFレセプター遺伝子の解析

G-CSF超大量投与治療で好中球が増力した時点で採取した白血球より抽出したRNAより既報告より突然変異の報告の多い部分のcDNA(nucleotide 2204-2771)についてcDNAを増幅しSSCPにて突然変異の有無を検索した。使用したPrimerは5'GAGGAGGATGCCTTCCAGC-3'、5'-GTTTTTAGTCATGGGCTTATGG-3'である。cDNA増幅後、RIにてラベルし5%アクリルアミドゲル電気泳動を行ったが対照と泳動度に差は認められず、増幅部分のDNA内に変異はないと判断した。Genomic DNAよりprimerを用いてGCSF receptorの翻訳領域をすべて含む領域の増幅を試みた。反応条件は、primer pair 1についてはdegeneration 95℃ 12秒、annealing 58℃ 6秒,extension 72℃ 30秒 30サイクルとした。primer pair2は同様にdegeneration 95℃ 12秒、annealing 60℃ 6秒,exension 72℃ 30抄 30サイクル、priner 3はdegeneration 95℃ 12秒、annealing 62℃ 6秒、extension 72℃ 30秒 30サイクノレで施行したところprimer 2,3pairについては単一のバンドが増幅され、アガロースゲルを用いて増幅された遺伝子の切り出しを行い精製後、現在蛍光色素を用いてサンガー法にで直接塩基配列決定法により塩基配列を決定中である。primer pair 1については予想されるバンドが単一には増幅されず現在そのPCR法の増幅条外を検討中である。

G-CSF超大量投与治療で好中球が増力した時点で採取した白血球より抽出したRNAより既報告より突然変異の報告の多い部分のcDNA(nucleotide 2204-2771)についてcDNAを増幅しSSCPにて突然変異の有無を検索した。使用したPrimerは5'GAGGAGGATGCCTTCCAGC-3'、5'-GTTTTTAGTCATGGGCTTATGG-3'である。cDNA増幅後、RIにてラベルし5%アクリルアミドゲル電気泳動を行ったが対照と泳動度に差は認められず、増幅部分のDNA内に変異はないと判断した。Genomic DNAよりprimerを用いてGCSF receptorの翻訳領域をすべて含む領域の増幅を試みた。反応条件は、primer pair 1についてはdegeneration 95℃ 12秒、annealing 58℃ 6秒,extension 72℃ 30秒 30サイクルとした。primer pair2は同様にdegeneration 95℃ 12秒、annealing 60℃ 6秒,exension 72℃ 30抄 30サイクル、priner 3はdegeneration 95℃ 12秒、annealing 62℃ 6秒、extension 72℃ 30秒 30サイクノレで施行したところprimer 2,3pairについては単一のバンドが増幅され、アガロースゲルを用いて増幅された遺伝子の切り出しを行い精製後、現在蛍光色素を用いてサンガー法にで直接塩基配列決定法により塩基配列を決定中である。primer pair 1については予想されるバンドが単一には増幅されず現在そのPCR法の増幅条外を検討中である。