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ウイルスベクターを用いた動物個体レベルでの網膜神経細胞への外来遺伝子導入-遺伝子治療を目指した基礎研究

使用病毒载体将外源基因引入动物个体的视网膜神经细胞 - 基因治疗的基础研究

基本信息

批准号：
09771425
负责人：
小坂淳
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Okayama University (1998)Osaka University (1997)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

哺乳類の視神経は、切断されると再生しない。一方、キンギョやイモリ等の視神経は、傷つけられても自然再生することが知られている。この脊椎動物の種による視神経再生能力の這いは、軸索伸長に関わる分子の発現が、種により異なることに起因すると考えられている。そこで、哺乳類でこれら遺伝子の発現を探査し、さらに動物個体レベルで操作することが、次の研究として想定される。しかし、Knockoutや、Transgenicの技術が確立しているマウスと異なり、複神経再生研究に用いられるラット、ネコでは、動物個体レベルの遺伝子操作は容易ではない。そこで、ウイルス・ベクターを用いて、成熟ラットの動物個体レベルで網膜神経節細胞に外来遺伝子を導入し、強制発現させることを目指した。LacZを組み込んだヒト5型アデノウイルス・ベクター,AsCALacZを2.0×10^8pfu/mlに調整し、ラット胎児由来網膜神経細胞の初代培養に、培養液1.5mlに対して3μl添加することにより感染させた。その結果、グリア系細胞及び、神経細胞双方がLacZ陽性に染色された。本法のMOIを、過去の研究者の結果と比較すると、約6倍の効率で遺伝子導入に成功していた。次に、同ベクターを成熟ラット硝子体内へ同じ濃度で10μl注入した。fast blueで着色されたウイルス液は、注入部位である耳側から、鼻側へ拡がった。48時間後、眼球の縦断切片を作成し、LacZ陽性細胞を染色したところ、14例中5例で、LacZ陽性細胞が主として耳側に見いだされた。陽性細胞の大部分は典型的なミュラー細胞であり、一部神経細胞様の細胞もLacZ陽性に染色された。

Mammals 'visual system is cut off and regenerated. A side, a side, a side. The ability of vertebrate species to regenerate their neurons is related to the development of molecules and the causes of species diversity. The discovery of mammalian genes and the operation of individual animals are investigated. The technology of Knockout and Transgenic has been established. It is easy to operate the gene in the research of regeneration of brain. The introduction of foreign genes into retinal ganglion cells and the development of stress are the main objectives of this study. LacZ group: AsCALacZ 2.0×10^8pfu/ml, adjusted to 1.5ml of culture medium added to 3μl of retinal nerve cells. LacZ positive staining was found in both human and neurocytes. The MOI of this method was compared with the results of previous researchers, and the efficiency of gene introduction was about 6 times higher. In addition, the same concentration of nitrate in the body was 10μl injected. Fast blue staining, injection site, ear side, nose side 48 hours later, the sections of the eyeball were prepared, LacZ positive cells were stained in 5 of the 14 cases, LacZ positive cells were mainly seen in the ear. Most of the positive cells were typical lacZ positive cells, and one neuron was lacZ positive cells.