歯髄細胞細胞膜に対する水酸化カルシウムの影響(イオンチャネルレベルでの解析)

歯髄細胞及び象牙芽細胞の機能面を解析するためにパッチクランプ法を用い、一個の培養ヒト歯髄細胞及び象牙芽細胞の動態をミリ秒単位で調べた。歯髄細胞は、ウ蝕のないヒトの抜去歯牙より無菌的に取り出した歯髄片をDMEM液(牛胎児血清、抗生物質を含む)で培養し、増殖した細胞を継代培養した。象牙芽細胞はラットの切歯を幅0.3〜0.5mmの厚さに切断し、歯髄を含む歯牙のスライス標本を作製し、標本はさらに半分に分離し、コラゲナーゼ(3mg/mL)とプロテアーゼ(0.25mg/mL)で37℃、5%CO_2、20分間で酵素処理を行った。象牙芽細胞は歯牙の歯髄側と歯髄体の表面に見られ、形態学的に他の歯髄細胞と区別できた。被験細胞を倒立顕微鏡のステージ上の実験容器に移し、通常のK^+-電極内液で満たしたパッチ電極を用い、歯髄細胞をホールセル状態にした。パッチ電極で検出した電流値は増幅された後、パソコン内のハードディスクに記録した。前年度、培養歯髄細胞で発生する電流を解析し、歯髄細胞の有するイオンチャネルを検討した。また、K^+チャネルの阻害剤であるBa^<2+>の細胞膜特性に対する効果についても調べた。今年度、象牙芽細胞において、同様の効果を検討した。培養歯髄細胞では、10mM Ba溶液で灌流した時、3種類の応答パターンが得られた。(1)Ba^<2+>によって漏洩電流が増強されるタイプ、(2)外向き電流がBa^<2+>によって抑制されるタイプ、(3)0 mV付近にピークを持つ内向き電流を発生するタイプの3種類である。象牙芽細胞では、パッチ電極でホールセル状態にした細胞の表面をB_a溶液で灌流した時、外向きの整流性の電流が抑制され、K^+チャネルの存在の可能性が示唆された。また、膜電位変化から象牙芽細胞は培養細胞の第2のタイプと類似していた。また、水酸化カルシウムとの関連では、水酸化カルシウムは難溶性で十分な濃度の水溶液を作ることが困難なこと、また、pHが高いため細胞膜の損傷が大きいことなどから、十分な結果が得られなかった。今後、溶液の濃度、pHのコントロールにさらなる研究が必要である。

歯髄細胞及び象牙芽細胞の機能面を解析するためにパッチクランプ法を用い、一個の培養ヒト歯髄細胞及び象牙芽細胞の動態をミリ秒単位で調べた。歯髄細胞は、ウ蝕のないヒトの抜去歯牙より無菌的に取り出した歯髄片をDMEM液(牛胎児血清、抗生物質を含む)で培養し、増殖した細胞を継代培養した。象牙芽細胞はラットの切歯を幅0.3〜0.5mmの厚さに切断し、歯髄を含む歯牙のスライス標本を作製し、標本はさらに半分に分離し、コラゲナーゼ(3mg/mL)とプロテアーゼ(0.25mg/mL)で37℃、5%CO_2、20分間で酵素処理を行った。象牙芽細胞は歯牙の歯髄側と歯髄体の表面に見られ、形態学的に他の歯髄細胞と区別できた。被験細胞を倒立顕微鏡のステージ上の実験容器に移し、通常のK^+-電極内液で満たしたパッチ電極を用い、歯髄細胞をホールセル状態にした。パッチ電極で検出した電流値は増幅された後、パソコン内のハードディスクに記録した。前年度、培養歯髄細胞で発生する電流を解析し、歯髄細胞の有するイオンチャネルを検討した。また、K^+チャネルの阻害剤であるBa^<2+>の細胞膜特性に対する効果についても調べた。今年度、象牙芽細胞において、同様の効果を検討した。培養歯髄細胞では、10mM Ba溶液で灌流した時、3種類の応答パターンが得られた。(1)Ba^<2+>によって漏洩電流が増強されるタイプ、(2)外向き電流がBa^<2+>によって抑制されるタイプ、(3)0 mV付近にピークを持つ内向き電流を発生するタイプの3種類である。象牙芽細胞では、パッチ電極でホールセル状態にした細胞の表面をB_a溶液で灌流した時、外向きの整流性の電流が抑制され、K^+チャネルの存在の可能性が示唆された。また、膜電位変化から象牙芽細胞は培養細胞の第2のタイプと類似していた。また、水酸化カルシウムとの関連では、水酸化カルシウムは難溶性で十分な濃度の水溶液を作ることが困難なこと、また、pHが高いため細胞膜の損傷が大きいことなどから、十分な結果が得られなかった。今後、溶液の濃度、pHのコントロールにさらなる研究が必要である。