大腸菌supFを標的遺伝子とした変異スペクトル解析用トランスジェニックマウス系の樹立

建立针对大肠杆菌supF的突变谱分析转基因小鼠系

• 批准号: 09780487
• 负责人: 布柴 達男
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09780487/
• 关键词: 突然変異スペクトル; supF遺伝子; 活性酸素(OH・); 塩化コバルト; 8-oxoG

今年度は、昨年度確立に成功した変異supF遺伝子を確実に選択可能な変異体選択システムを用い、大腸菌の自然および誘発突然変異のスペクトルを検討すること、トランスジェニックマウス系の予備実験として、SupFをゲノムにもつ哺乳類細胞変異スペクトル解析系の樹立を目的とした。成果1)M13ファージを用いたssDNAの調整を可能にすることで、変異選択後のシーケンスをスムースに行えるように、M13ファージの複製開始点であるf1 oriを導入した新しいplasmidpTN89を作成し、このplasmidと昨年度確立した変異選択システムを用い、活性酸素の消去酵素と鉄の取り込み調節タンパク質欠損大腸菌に生じる自然突然変異スペクトルを検討し、活性酸素による代表的なDNA損傷である8-oxoGに由来すると見られる、GC>>TA、AT>>OGが有意に増加することを確認した(布柴ら、1998;Obata et al.,1998)。成果2)また同様の系により発ガン性重金属のコバルトが誘発する変異スペクトルを解析した(Ogawa et al.,in press)。成果3)現在さらにこの系を応用し、標的supF遺伝子をplasmidの複製方向に対して、順・逆向きに導入した2種のplasmidを新たに作成し、突然変異の固定における複製鎖特異性を塩基レベルで解析する系を樹立した。活性酸素による代表的なDNA損傷である8-oxoGの修復系を欠いたmutMmutY株、ヌクレオチドプールの8-oxodGTPの分解系を欠いたmutT株を用い、DNAに8-oxoGがある場合の変異の固定に複製鎖特異性があるか否か、プールに存在する8-oxodGTPの取り込みに複製鎖特異性があるか否かを検討している。成果4)supF(+)をマーカーとしてのneo遺伝子とともに挿入されたλファージZAPII/supFneoを作成し、そのDNAをマウス乳がん細胞由来のFM3Aに導入し、哺乳類細胞変異スペクトル解析系の構築を試みた。ネオマイシン抵抗性を指標に、トランスフェクションされた細胞計11株について、PCR法とサザン法により、マウスゲノム中に取り込まれたλDNAおよびsupFのコピー数を推定したところ、突然変異解析系として用いるには十分なコピー数の細胞株は得られなかった。おそらくは、amber codonに対してTyrを挿入することでamber変異をサプレスするというsupFの性質が、amber終始コドンへのTyrの挿入を起こし、多コピー存在すると致死的に働くため、突然変異解析系として好ましいsupFが多コピー存在する細胞の樹立が困難であるものと思われる。

Our は, establishment of yesterday's annual に successful し た - traces of different supF 伝 を son really be に sentaku may な - variant sentaku シ ス テ ム を い, coliform の natural お よ び 発 lure suddenly - different の ス ペ ク ト ル を beg す 検 る こ と, ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク マ ウ ス is の reserve be 験 と し て, supF を ゲ ノ ム に も つ mammalian cells - different ス ペ ク ト ル The analysis system sets the を objective と た た. Results 1) the M13 フ ァ ー ジ を with い た ssDNA の adjustment を may に す る こ と で, - different after sentaku の シ ー ケ ン ス を ス ム ー ス に line え る よ う に, M13 フ ァ ー ジ の copy starting point で あ る f1 Ori を import し た new し い plasmidpTN89 を し, consummate こ の plasmid と yesterday annual establish し た - different sentaku シ ス テ ム の を い, active acid element elimination enzyme と iron objects の take り 込 み adjust タ ン パ ク qualitative owe damage of coliform に raw じ る natural suddenly - different ス ペ ク ト ル を beg し 検, active acid に よ る representative な DNA damage Injury で あ る 8 - oxoG に origin す る と see ら れ る, GC > > TA, AT > > OG が intentionally に raised plus す る こ と を confirm し た (wood ら, 1998; Obata et al., 1998). Results 2) ま た with others の is に よ り 発 ガ ン sex heavy metal の コ バ ル ト が 発 lure す る - different ス ペ ク ト ル を parsing し た (Ogawa et al., in press). Results 3) now さ ら に こ の is を 応 し, mark supF heritage 伝 son を plasmid の replication direction に し seaborne て, shun DE reverse き に import し た two の plasmid を new た に made し, suddenly - different の fixed に お け る copy locked specificity を salt base レ ベ ル で parsing す を る department set up し た. Active acid element に よ る represent な DNA damage で あ る 8 - oxoG の repair department を owe い た mutMmutY strains, ヌ ク レ オ チ ド プ ー ル の 8 - oxodGTP の decomposition is を owe い た mutT strains を い, DNA に 8 - oxoG が あ の る occasions - different の fixed に copy locked specificity が あ る か no か, プ ー ル に exist Youdaoplaceholder0 8-oxodGTP <s:1> take 込みに replicate lock specificity がある を検 no を検 を検 seek る て る る る. Results 4) supF (+) を マ ー カ ー と し て の neo heritage 伝 son と と も に scions into さ れ た lambda フ ァ ー ジ ZAPII/supFneo を し, consummate そ の DNA を マ ウ ス milk が ん cell origin の FM3A に import し, mammalian cells - different ス ペ ク ト ル parsing is の build を try み た. ネ オ マ イ シ ン resistance を index に, ト ラ ン ス フ ェ ク シ ョ ン さ れ た cell meter 11 strains に つ い て, PCR method と サ ザ ン method に よ り, マ ウ ス ゲ ノ ム に take in り 込 ま れ た lambda DNA お よ び supF の コ ピ ー number を presumption し た と こ ろ, suddenly - different analytical と し て in い る に は very な コ ピ ー number の cell lines は must ら れ Youdaoplaceholder0 った. Youdaoplaceholder0 おそらく, amber Codon に し seaborne て Tyr を scions into す る こ と で amber - different を サ プ レ ス す る と い う supF の properties が, amber beginning コ ド ン へ の Tyr の scions into を up こ し, multiple コ ピ ー exist す る と death に 働 く た め, suddenly - different analytical と し て good ま し い supF が more コ ピ ー exist す が の る cells Difficulty である である と と thought われる.

项目成果

H.Ogawa: "Cobaltous chloride-induced mutagenesis in the supF tRNA gene of Escherichia coli" Environmental Molecular Mutagenesis. (in press).

H.Okawa：“氯化钴诱导的大肠杆菌 suF tRNA 基因诱变”环境分子诱变。

布柴達男: "活性酸素と自然突然変異スペクトル" 放射線生物研究. 33. 25-46 (1998)

Tatsuo Nunoshiba：“活性氧和自发突变谱”放射生物学研究33。25-46（1998）。

F.Obata: "An improved system for selection of forward mutations in an Escherichia coli supF gene carried by plasmids" Journal of Radiation Research. 39. 263-270 (1998)

F.Obata：“一种用于选择质粒携带的大肠杆菌supF基因正向突变的改进系统”《辐射研究杂志》。

布柴達男: "活性酸素と自然突然変異スペクトル" 放射線生物研究. 33 (1),(印刷中). (1998)

Tatsuo Nunoshiba：“活性氧和自发突变谱”放射生物学研究33（1），（出版中）。