プテリジン補酵素生成系におけるCa^<2+>依存性タンパク質リン酸化制御機構の解析

蝶啶辅酶生产系统中Ca^2+依赖性蛋白磷酸化控制机制分析

• 批准号: 10771018
• 负责人: 藤本 健吾
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Meikai University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771018/
• 关键词: セピアプテリン還元酵素; プテリジン補酵素; Ca^<2+>依存性リン酸化; 触媒部位; リン酸化部位; site-directed mutagenesis法

プテリジン補酵素生産におけるCa^<2+>依存性protein kinaseの制御機構を明らかにするため、セピアプテリン還元酵素(SPR)の触媒部位とリン酸化部位の決定を行った。まず、精製の困難なSPRを大腸菌により大量発現させ、硫安分画とアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。触媒部位と考えられる部分のアミノ酸を他のアミノ酸に変換したポイントミュータントSPRをsite-directed mutagenesis法でそれぞれ作製した。ミュータントSPRとnative SPRの基質と補酵素に対する活性を比較することにより、チロシン171、セリン158、リジン175がSPRの触媒部位であることが決定された(BBA誌,1431,306-341,1999)。またSPRをCaM KIIでリン酸化し、抗セリン/スレオニン抗体で反応を見た結果、セリン残基のみがリン酸化されていることが判明した。そこで、CaM KIIでリン酸化したSPRをリジルエンドペプチダーゼ処理し、それぞれのフラグメントをHPLCにより分離した。リン酸化されたペプチドをシークエンスした結果、CaM KIIリン酸化コンセンサスシークエンス(X-Arg-X-X-Ser/Thr)を3つ含んでいた。以上のことから、リン酸化されていると考えられるセリン46、セリン169、セリン214をアラニンに変換させたポイントミュータントSPRを作製した。その結果、全てのセリン残基をアラニンに変換させたミュータントSPRは、CaM KIIによるリン酸化を全く受けなかったが、それぞれ1つのセリン残基を残し、他をアラニンに変換させたミュータントSPRはリン酸化された。このことより、セリン46、セリン169、セリン214がCaM KIIによってリン酸化されるアミノ酸であることが決定された(in contribution)。

The regulatory mechanism of Ca^<2+>-dependent protein kinases in the production of SPR was investigated. It is difficult to refine SPR coliform bacteria. It is difficult to refine SPR coliform bacteria. The catalyst site is prepared by site-directed mutagenesis. The activity of SPR and native SPR substrates and complementary enzymes was compared and determined (BBA Journal, 1431, 306 - 341, 1999). The results of the anti-SPRs and anti-SPRs assay were as follows: For example, CaM KII can be used for the separation of organic compounds by HPLC. CaM KII acid reaction (X-Arg-X-Ser/Thr) is a 3-step process. In the case of the above, it is necessary to change the state of affairs from the state of affairs to the state of affairs. The results showed that all the residues in the protein were replaced by SPR and CaM KII, and all the residues in the protein were replaced by SPR. This decision was made (in contribution) by CaM KII, CaM 46, CaM 169, CaM 214 and CaM KII.

项目成果

Kengo Fujimoto: "Functionally important residues tyrosine-171 and serine-158 in sepiapterin reductase"Biochimica et Biophysica Acta. 1431. 306-314 (1999)

Kengo Fujimoto：“墨蝶呤还原酶中功能重要的残基酪氨酸 171 和丝氨酸 158”《生物化学与生物物理学学报》。

今川信吾: "交感神経系biopterin cofactor生成酵素の^<2+>依存性リン酸化制御" 明海大学歯学誌. 27(2). 147-175 (1998)

Shingo Imakawa：“交感神经系统中生物蝶呤辅因子生成酶的^<2+>依赖性磷酸化调节”《明海大学牙科杂志》27(2)(1998)。