病因論に基づいた歯周病の遺伝子診断法の開発

歯周病細菌であるPorphyromonas gingivalis、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Treponema denticolaについて既に報告されている遺伝子の特異的な塩基配列を基に、PCR法で特異的遺伝子断片を増幅するための特異プライマーを、また16SリボゾームRNAの塩基配列を基に、口腔内細菌叢を構成する全ての細菌を検出できるユニバーサルプライマを作製した。さらに、上記の特異プライマーとユニバーサルプライマーに増幅されない、PCR法でのポジティブコントロールとなるスタンダードDNAおよびスタンダードDNAの特異プライマーを作製した。これらのプライマーを用いて同一条件のもとで最短の反応時間でPCR産物を検出できる至適条件を検討し、各種細菌が同時に検出可能となった。歯周病細菌および種々の口腔細菌について様々な濃度の染色体DNAを調製し、既知濃度のスタンダードDNAを加え、これらを用いて各特異プライマーおよびユニバーサルプライマーによりマルチプレックスPCRを行い、各特異プライマーについてはその特異性を、ユニバーサルプライマーについてはその非特異性を確認した。各PCR産物よりの1本鎖DNAをターゲットとするDNAプローブを作製し、マイクロタイタープレートを用いたサンドウィッチハイブリダイゼーションによる発色にて、マルチプレックスPCRを用いて得たPCR産物を定量的に解析した。現在まで、予防歯科外来で121名の様々な病型の歯周炎患者から承諾を得て、630歯より歯垢をサンプリングし、この定量解析により菌数を推定し、検査結果と病態の変化を経時的調査しているが、本診断法の診断基準や臨床応用法を確立するには、さらに、臨床に適したサンプリングの方法や、歯周病細菌とその特異プライマーの種類などについての再設定が必要である。

歯周病細菌であるPorphyromonas gingivalis、Actinobacillus actinomycetemcomitans、Treponema denticolaについて既に報告されている遺伝子の特異的な塩基配列を基に、PCR法で特異的遺伝子断片を増幅するための特異プライマーを、また16SリボゾームRNAの塩基配列を基に、口腔内細菌叢を構成する全ての細菌を検出できるユニバーサルプライマを作製した。さらに、上記の特異プライマーとユニバーサルプライマーに増幅されない、PCR法でのポジティブコントロールとなるスタンダードDNAおよびスタンダードDNAの特異プライマーを作製した。これらのプライマーを用いて同一条件のもとで最短の反応時間でPCR産物を検出できる至適条件を検討し、各種細菌が同時に検出可能となった。歯周病細菌および種々の口腔細菌について様々な濃度の染色体DNAを調製し、既知濃度のスタンダードDNAを加え、これらを用いて各特異プライマーおよびユニバーサルプライマーによりマルチプレックスPCRを行い、各特異プライマーについてはその特異性を、ユニバーサルプライマーについてはその非特異性を確認した。各PCR産物よりの1本鎖DNAをターゲットとするDNAプローブを作製し、マイクロタイタープレートを用いたサンドウィッチハイブリダイゼーションによる発色にて、マルチプレックスPCRを用いて得たPCR産物を定量的に解析した。現在まで、予防歯科外来で121名の様々な病型の歯周炎患者から承諾を得て、630歯より歯垢をサンプリングし、この定量解析により菌数を推定し、検査結果と病態の変化を経時的調査しているが、本診断法の診断基準や臨床応用法を確立するには、さらに、臨床に適したサンプリングの方法や、歯周病細菌とその特異プライマーの種類などについての再設定が必要である。