遺伝学的手法を用いた歯周病細菌の高感度迅速定量法の開発

歯周病細菌であるActinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis、Treponema denticola、Bacteroides forsythus、Campylobacter rectus、Eikenella corrodens、Prevotella intermedia、Prevotella nigrescenceについて既に報告されている遺伝子の特異的な塩基配列を基に、PCR法で特異的遺伝子断片を増幅するための特異プライマーを、また16SリボゾームRNAの塩基配列を基に、口腔内細菌叢を構成する全ての細菌を検出できるユニバーサルプライマーを作製した。これらのプライマーを用いて同一条件のもとで最短の反応時間でPCR産物を検出できる至適条件を検討し、各種細菌が同時に検出可能となった。各歯周病細菌で様々な濃度の染色体DNAを調製し、これらをテンプレートDNAとして各歯周病細菌の特異プライマーまたはユニバーサルプラィマー、そして各々のTaqManプローブによる、ABIPRISMTM7700Systemを用いたリアルタイムPCR法にてPCR産物の定量解析を行い、各特異プライマーについてはその特異性を、ユニバーサルプライマーについてはその非特異性を確認した。さらに、様々な濃度の菌懸濁液を調製して前述の方法で定量解析を行い、細菌検査の定量における基準を設定しようとしている。現在、口腔ケア・予防科外来で様々な病型の歯周炎患者から承諾を得て、歯垢をサンプリングし、この定量解析により菌数を推定し、検査結果と病態の変化を経時的調査しているが、臨床応用法を確立するには、臨床に適したサンプリングの方法や、歯周病細菌とその特異プライマーの種類などについての再設定の検討、さらには歯周病の細菌以外の発病因子への考慮などが必要である。

歯周病細菌であるActinobacillus actinomycetemcomitans、Porphyromonas gingivalis、Treponema denticola、Bacteroides forsythus、Campylobacter rectus、Eikenella corrodens、Prevotella intermedia、Prevotella nigrescenceについて既に報告されている遺伝子の特異的な塩基配列を基に、PCR法で特異的遺伝子断片を増幅するための特異プライマーを、また16SリボゾームRNAの塩基配列を基に、口腔内細菌叢を構成する全ての細菌を検出できるユニバーサルプライマーを作製した。これらのプライマーを用いて同一条件のもとで最短の反応時間でPCR産物を検出できる至適条件を検討し、各種細菌が同時に検出可能となった。各歯周病細菌で様々な濃度の染色体DNAを調製し、これらをテンプレートDNAとして各歯周病細菌の特異プライマーまたはユニバーサルプラィマー、そして各々のTaqManプローブによる、ABIPRISMTM7700Systemを用いたリアルタイムPCR法にてPCR産物の定量解析を行い、各特異プライマーについてはその特異性を、ユニバーサルプライマーについてはその非特異性を確認した。さらに、様々な濃度の菌懸濁液を調製して前述の方法で定量解析を行い、細菌検査の定量における基準を設定しようとしている。現在、口腔ケア・予防科外来で様々な病型の歯周炎患者から承諾を得て、歯垢をサンプリングし、この定量解析により菌数を推定し、検査結果と病態の変化を経時的調査しているが、臨床応用法を確立するには、臨床に適したサンプリングの方法や、歯周病細菌とその特異プライマーの種類などについての再設定の検討、さらには歯周病の細菌以外の発病因子への考慮などが必要である。