ヒトマウスSim2遺伝子の発現調節機構とダウン症精神遅滞

人鼠Sim2基因表达与唐氏综合征智力低下的调控机制

• 批准号: 10771337
• 负责人: 八巻 明子
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Kyorin University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 1999
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-10771337/
• 关键词: ダウン症候群; Sim2遺伝子; 転写開始点; プロモーター領域; 転写因子; cis-エレメント; ゲルシフトアッセイ; GFP; 欠失変異体; ルシフェラーゼ活性

(1)ヒト21番染色体長腕q22.2上に座位するSIM2遺伝子の転写機構を明らかにするために、ルシフェラーゼ発現ベクター(pGL3-Basic)へ組み込んだSIM2遺伝子転写調節領域の解析から、転写開始点上流-1385〜1325の60-bpの領域に強いルシフェラーゼが見られた。この60-bpの領域に存在する既知のcis-エレメントをコンピュータ検索(TFSEARCH)し、E2F、c-myb、E47の3種の転写因子結合部位が予測された。それぞれ因子の結合部位のコンセンサス配列から1塩基のみを変異させ、同様にプロモーター活性を測定したところ、E2F変異体では野生型に比べ活性が1.5倍増加した。c-myb結合領域がSIM2遺伝子の転写機構に何からの影響をもたらすことが示唆された。また、60-bpの領域内から作製した8種類の配列(c-mybW1〜W5、c-mybM、E47W、E47M)を用いてゲルシフトアッセイを行った。c-mybコンセンサス配列を^<32>P放射性プローブ(c-mybW1)にし、8種類を非放射性プローブとして競合実験を行ったところ、c-mybW1とc-mybコンセンサス配列からわずか2-bp上流にずらし下流5-bp短くしたプローブ(c-mybW4)においてシフトバンドの消失が起こった。8種類を全て放射性プローブにしてゲルシフトアッセイを行ったところ、競合実験と同じくc-mybW1とc-mybW4に特異的なシフトバンドが検出された。今後はシフトバンドからSIM2遺伝子特異的な転写制御因子が何かを同定する(2)ヒトSIM2蛋白質の各ドメインをグリーン蛍光蛋白質(GFP)発現ベクター(pEGFP-N1)に組み込み、ヒトSIM2蛋白質との融合蛋白をグリオブラストーマ由来のT98G細胞内に発現させ蛍光顕微鏡を用いて細胞内発現を観察した。結果、ヒトSIM2蛋白質全長を発現させると核内に発現が見られるが、N末端のbHLHドメインのみでは細胞全体に、bHLH-PASドメインのみでは細胞質内に局在し、中央付近のHSTドメインのみでもbHLH-PASドメインのみとは異なる発現パターンであるが細胞質内に局在することが分かった。今後は、C末端における発現パターンの検討や、詳細な細胞質内局在について検討する。

(1)SIM2 gene coding mechanism on chromosome 21 at locus q22.2 is clearly identified as a coding mechanism (pGL3-Basic). The coding mechanism of SIM2 gene coding regulatory domain is identified as a coding start point upstream of-1385 1325. The 60-bp domain contains known cis-myb, TFSEARCH, E2F, c-myb and E47 binding sites. The binding sites of all the factors were separated by a single nucleotide sequence and the same nucleotide sequence. The binding activity of E2F was 1.5 times higher than that of the wild type. c-myb binding domain for SIM-2 transmission mechanism 8 kinds of alignment (c-mybW1 ~ W5, c-mybM, E47W, E47M) are used in the 60-bp domain. c-myb <32>C-C-C- 8 species of radioactive substances are detected in the same way as c-mybW1 and c-mybW4. In the future, we will determine the identity of SIM2 gene specific regulatory factors.(2) To investigate the intracellular development of SIM2 protein fusion protein (GFP) in T98G cells using light microscopy, we will investigate the origin of SIM2 protein fusion protein (pEGFP-N1). As a result, the full length of SIM2 protein was found in the nucleus, the N-terminal bHLH receptor was found in the whole cell, the bHLH-PAS receptor was found in the cytoplasm, and the central HST receptor was found in the cytoplasm. In the future, C-terminal detection and detailed cytoplasmic detection will be conducted.