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一酸化窒素合成酵素のカルモジュリン、リン脂質、リン酸化による活性調節機構の解明

阐明钙调蛋白、磷脂和磷酸化对一氧化氮合酶活性的调节机制

基本信息

批准号：
10780391
负责人：
松原守
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Fujita Health University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、nNOS,eNOS,iNOSの各アイソフォームのカルモジュリン結合ドメインに着目し、このドメインと酸性リン脂質、カルモジュリンなど各種エフェクターとの相互作用、リン酸化によるその調節機構を解明することを目的としている。また、NOSのリン酸化は、NO産生を調節する重要な機構の一つであるがその詳細は明らかでなく、各NOSアイソフォームのリン酸化解析が必要である。本年度は、各NOSアイソザイムのPKCによるリン酸化について明らかにした。血管内皮細胞型NOS(eNOS)では、大腸菌で発現させたeNOSはin vitroでPKCによりリン酸化された。部位特異的リン酸化抗体及び質量分析の結果からPKCによるリン酸化部位はカルモジュリン結合ドメインの中のThr497であることを同定した。ウシの血管内皮細胞から免疫沈降したeNOSは、リン酸化されたThr497を認識する部位特異的リン酸化抗体により反応し、さらにPKCのアクチベーターであるPMAによりその反応性が増加した。更に、eNOSの活性は、PKCによるリン酸化によりカルモジュリンと結合できなくなるため減少することが分かった。以上の結果から、eNOSの活性は細胞内でPKCによりnegativeに調節されていることが明らかとなった。同様に、神経型NOS(nNOS)についてもPKCによりリン酸化されることを示した。一方、誘導型NOS(iNOS)はPKCでリン酸化されず、別のキナーゼが関与していることが推測された。

The purpose of this study is to study the interaction and acidification of various kinds of acid fatty acid, acid The important institutions of NOS, NOS and NO are required to analyze the necessary acidizing conditions. In the current year, all NOS companies have been asked to PKC the acidizing process. Vascular endothelial cell type NOS (eNOS) was detected by eNOS, in vitro, PKC, acidification. The results of PKC specific acidification antibody and quantitative analysis showed that the acidified site was homologous to Thr497 antigens. Vascular endothelial cells were immunized with eNOS, acidified, Thr497 antibodies were acidified, antibodies were acidified, anti-antibodies were detected, PKC antibodies were added, PMA cells were immunized, anti-antibodies were added. Change, eNOS activity, PKC activity, acidify, acid, acid and acid. The results of the above results showed that the activity of eNOS was significantly higher than that of intracellular PKC. Negative activity was significantly higher than that of intracellular DNA. In the same way, NOS (nNOS) of the same type shows that the acid is acidified, and the PKC is the same. One side, NOS (iNOS), PKC, acid, acid and acid.