出芽酵母で見られる細胞死を伴う異常なDNA合成反応の解析

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ORC(origin recognition complex)は、出芽酵母において最初に単離されたDNA複製の開始に必須な因子であり、今ではこれは種を越えてヒトまで広く保存されて存在することが分かっている。出芽酵母orc2-1株はORC中2番目に大きなサブユニットであるORC2に点突然変異を持つ温度感受性変異株であるが、この株は非許容温度にてDNA複製開始に異常をきたし細胞周期中G1/S停止を起こす。ところがおもしろいことにこのG1/S停止は一過的なものであり、その後しばらくして新たなDNA合成がゆっくりと始まり、最終的には2NのDNA含量を持つG2/M停止を示す。興味深いことに、このDNA合成の開始と時を同じくして細胞の生存率の低下が見られる。そこで申請者は、この二次的なDNA合成と細胞死との因果関係を明らかにするために以下の実験を行った。Orc2-1株を紫外線による変異誘導を行った後、一過的な非許容温度培養においても元株よりも生存率の上昇した株を単離した。この時にORC2の復帰変異株の可能性を排除するため、非許容温度では増殖できない株のみを選択した。現在はこれらの株をFACS解析にかけ、非許容温度時に細胞周期のどのステージで停止しているかを解析している。申請者はそれとは別に、CLN1(本来はG1の後期にのみ一過的に発現)の構成的な過剰発現がorc2-1株を非許容温度時にG1/S停止させることを突き止めた。予備的な実験ではこの時細胞の死亡率が低下しており、細胞死と二次的DNA合成の関係を調べるに格好なシステムを得たと考えている。