複製フォーク進行速度を低下させるDNA断片(大腸菌染色体由来)の解析

分析降低复制叉进展速率的 DNA 片段（源自大肠杆菌染色体）

• 批准号: 05780515
• 负责人: 日高 真純
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Okazaki National Research Institutes
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05780515/
• 关键词: 大腸菌; DNA複製; 二次元寒天ゲル電気泳動; フィラメント; slow down活性; PCR; ORF

大腸菌染色体におけるDNA合成速度はほぼ一定で、1秒当たり約1kbという速い速度で進行していると考えられている。我々は、少なくともプラスミド上において、複製フォークの進行を遅くするという新しい活性(slow down活性)を有するDNA断片を大腸菌染色体上に2種類同定してきた。二次元寒天ゲル電気泳動法による解析により、この活性は、特定部位でのフォーク阻害ではなく、プラスミド上においてほぼ一様に一方向の時のみにフォークの進行速度を低下させることが解った。さらに、この活性と対応して、このプラスミドを持つ菌はフィラメント状に伸び、核の形態も異常になることが判明した。本年度は、このslow down活性の直接的シグナルが、(a)DNA上のcisに働く特異な配列 (b)クローンDNA上の転写と複製の衝突 (c)クローンDNA上からの転写産物(タンパク質)の影響の3つ考えられる可能性の内のどれであるかを明らかにするために、プラスミドpUCベクター上のlacプロモーターの位置を逆にしたものを構築した。その時にslow down活性を示すDNA断片の向きを本来のものと比較することにより、この活性の原因は、(C)のクローンDNA上からの転写産物の過剰生産によることが明らかになった。同定された2種類のDNA断片の内の1つは、既にDNAの塩基配列が報告されており、そのDNA断片上に3つのORF(ORF1,2,3)をコードしている。そこで各ORFの欠失変異体をPCR方により作製し、それぞれのslow down活性を調べたところ、分子量108kDという大きなタンパク質をコードしていると思われるORF1を欠失した時にのみ、slow down活性は消失した。また、ORF2とORF3の両方を欠失させORF1のみを持たしたものはslow down活性を示した。これらのことより、ORF1によりコードされているタンパク質が、何らかの形でslow down活性に関与していることが明らかになった。同様な実験をもう一つのDNA断片にも適用するため、現在このDNA断片の塩基配列を決定しているところである。

The rate of DNA synthesis in E. coli chromosomes is constant, about 1kb per second. The DNA fragments on the chromosomes of Escherichia coli are identical in two species: DNA fragments on the chromosomes of Escherichia coli and DNA fragments on the chromosomes of Escherichia coli. Two-dimensional cold weather electrokinetic method analysis, activity, specific parts of the white, white In addition, the activity and morphology of the bacteria were detected. This year, the direct sequence of slow down activity is: (a) cis specific alignment on DNA;(b) transcription and replication conflicts on DNA;(c) the possibility of transcription and replication products on DNA; and (d) the reverse construction of lac position on DNA. The slow down activity of DNA fragments indicates that the DNA fragments are in the same direction as the original ones, and the reasons for the activity are (C) the slow down activity of DNA fragments and the production of DNA products. The ORFs (ORFs 1,2,3) of the DNA fragments of the two species were identified. The slow down activity of ORF1 was decreased when ORF 1 was decreased. ORF 2, ORF3, ORF1, ORF 2, ORF 3, ORF 3, ORF 4, ORF 5, ORF 6, ORF 7, ORF 8, ORF 9, ORF 9, ORF The activity of the activity is slow, and the activity is slow. The same applies to DNA fragments, and the same applies to DNA fragment alignment.