神経回路素子の活動を視覚化する手法の開発

本研究は神経系における特定の細胞集団を蛍光標識し、それらの細胞集団が示す生理反応をそれ以外の細胞から差別化して測定する手法の開発を目的とした。具体的にはGFP(Green Fluorescence Protein)とその改変体を利用して遺伝子工学的に細胞内カルシウム、膜電位などの測定を行う技術を開発する(測定技術の開発)とともに、神経組織由来の初代培養細胞にこれらの遺伝子産物を細胞種特異的なプロモーター(遺伝子の転写調節領域)を利用して発現させて標識し、標識された細胞を差別化して測定を行う(標識技術の開発)ことを目指した。測定技術の開発としては、GFPと既存のカルシウム蛍光色素との間で見られる相互作用に着目して試験管内の検討を行った。その結果、GFPとfura-redもしくはBFP、CFP(blueまたはcyanの蛍光を発するGFPの改変体)とfura-redを共存させた状態においてカルシウム依存的なGFP由来の蛍光の変化が見られた。これはfura-redのカルシウム依存的な吸収スペクトルの変化がGFPの蛍光、もしくは励起光に影響を与えているためと考えられる。今後はこの現象を細胞内カルシウムの測定に応用するべく、株化細胞を用いた開発を進めていきたいと考えている。標識技術の開発としては、リポフェクション法の改良と、各種プロモーターの利用により、ラット大脳皮質由来初代培養細胞においてGFPの発現させ、神経細胞とアストロサイトをそれぞれ差別化して標識し、既存のカルシウム色素、CCDカメラのシステムを利用してカルシウムを測定することに成功した。この内容については第22回日本神経科学会において発表し、Neuroscience Research誌に掲載された。

本研究は神経系における特定の細胞集団を蛍光標識し、それらの細胞集団が示す生理反応をそれ以外の細胞から差別化して測定する手法の開発を目的とした。具体的にはGFP(Green Fluorescence Protein)とその改変体を利用して遺伝子工学的に細胞内カルシウム、膜電位などの測定を行う技術を開発する(測定技術の開発)とともに、神経組織由来の初代培養細胞にこれらの遺伝子産物を細胞種特異的なプロモーター(遺伝子の転写調節領域)を利用して発現させて標識し、標識された細胞を差別化して測定を行う(標識技術の開発)ことを目指した。測定技術の開発としては、GFPと既存のカルシウム蛍光色素との間で見られる相互作用に着目して試験管内の検討を行った。その結果、GFPとfura-redもしくはBFP、CFP(blueまたはcyanの蛍光を発するGFPの改変体)とfura-redを共存させた状態においてカルシウム依存的なGFP由来の蛍光の変化が見られた。これはfura-redのカルシウム依存的な吸収スペクトルの変化がGFPの蛍光、もしくは励起光に影響を与えているためと考えられる。今後はこの現象を細胞内カルシウムの測定に応用するべく、株化細胞を用いた開発を進めていきたいと考えている。標識技術の開発としては、リポフェクション法の改良と、各種プロモーターの利用により、ラット大脳皮質由来初代培養細胞においてGFPの発現させ、神経細胞とアストロサイトをそれぞれ差別化して標識し、既存のカルシウム色素、CCDカメラのシステムを利用してカルシウムを測定することに成功した。この内容については第22回日本神経科学会において発表し、Neuroscience Research誌に掲載された。