コリネ型細菌におけるリン酸重合体依存キナーゼの役割とその構造・機能相関の解明

阐明磷酸聚合物依赖性激酶在棒状细菌中的作用及其结构-功能关系

• 批准号: 11760064
• 负责人: 河井 重幸
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11760064/
• 关键词: リン酸重合体; ATP; リン酸基供与体; NADキナーゼ; Micrococcus flavus; 結核菌; 単斜晶系; コリネ型細菌; グルコキナーゼ; ポリリン酸; エネルギー担体化学進化; NADキナーゼ遺伝子

無機リン酸がリン酸エステル結合で縮合したリン酸重合体は、ATPと同様にリン酸基供与体として機能していると考えられているが、その詳細は充分解明されていない。本申請研究は、リン酸重合体をリン酸基供与体とする酵素NADキナーゼの構造機能相関の解明を目的とした。今年度の研究で以下の知見を得た。グラム陽性細菌Micrococcus flavusより、リン酸重合体とATPの両方をリン酸基供与体として利用できる新規NADキナーゼを初めて精製し、これをリン酸重合体/ATP-NADキナーゼと命名した。本酵素の内部アミノ酸配列情報を基にして、M.flavus及び結核菌由来の本酵素遺伝子をクローニングし、両酵素の一次構造を決定した。これは、NADキナーゼ遺伝子の初めてのクローニング例であった。両酵素遺伝子を大腸菌内で大量発現させ、精製し、諸性質を決定した。両組み換えNADキナーゼは良く似た諸性質及び一次構造を示した。両精製酵素の結晶化条件を検討し、結核菌NADキナーゼの結晶化に成功した。本結晶は単斜晶系に属し、空間群はC2、格子定数はa=139.88 b=69.25 c=105.89Å β=130.06°、分解能は3.03Åであった。また、非対称単位中にサブユニットを2個を含むと推定された。測定された37,271個の反射の中で、独立反射は12,736個で完全性は97.9%、R_<sym>因子は8.4%であった。本結晶は、NADキナーゼの結晶として初めてのものであり、高い相同性を示す構造既知のタンパク質が知られていない。重原子置換による立体構造を決定するため、幾つかの重原子置換体を調製し、現在、重原子置換体の解析を試みている。一方、大腸菌及び酵母のゲノムデーターベース上に、リン酸重合体/ATP-NADキナーゼの一次構造と相同性を示す遺伝子を見いだした。これらの遺伝子をクローン化後、その産物の諸性質及び一次構造を決定した。その結果、大腸菌及び酵母のNADキナーゼは、リン酸重合体を利用できないATP特異的NADキナーゼであることが分かった。

Inorganic リン acid がリン acid エステル combined and condensed したリン acid condensate は, ATP and と に リン acid The fundamentals and functions of the body are fully explained in detail. The purpose of this application is to elucidate the structure and function of は, リン acid condensate を リ リ acid group donor and enzyme NAD キナーゼの. This year's research resulted in the following insights.グラム-positive bacteria Micrococcus flavusより, リン acid complex compound とATPの両を を リン acid group donor and body として utilization できる new regulations N ADキナーをInitially refined,これをリン acid complex/ATP-NADキナーゼと namedした. The internal amino acid composition information of this enzyme is based on the origin of M.flavus and tuberculosis bacteria, and the primary structure of the enzyme is determined.これは、NADキナーゼ伝子の初めてのクローニング Example であった.両Enzyme residues are found in large amounts in coliform bacteria and are refined, and their various properties are determined. The various properties and primary structure of the group are similar to each other.両The crystallization conditions of the purified enzyme were determined, and the crystallization of tuberculosis NAD was successfully achieved. This crystal has a clinic crystal system, a space group of C2, a lattice constant of a=139.88 b=69.25 c=105.89Å β=130.06°, and a decomposition energy of 3.03Å.また、にサブユニットを2 in the non-対single position contains むと and is presumed to be された. Measurement of 37,271 reflections, completeness of 12,736 independent reflections, 97.9%, and R_<sym> factor of 8.4%. This crystal has a high homogeneity and a high homogeneity. The structure is known and the quality is known. Heavy atom replacement is a three-dimensional structure determination, a few heavy atom replacement bodies are modulated, and now, a heavy atom replacement body is analyzed and tested. On the one hand, the coliform and the yeast のゲノムデーターベース上に, リン acid complex/ATP-NAD キナーゼのidentity is shown in the すす伝子を见いだした. After the transformation of the これらの缝子をクローン, the various properties and primary structure of the そのproduct are determined. The results of NAD, Escherichia coli and Yeast NAD and Rino acid complex use NAD NAD that is specific for NAD ATP.

项目成果

S.Kawai,S.Mori,T.Mukai,S.Suzuki,T.Yamada,W.Hashimoto & K.Murata: "Inorganic polyphosphate/ATP-NAD kinase of Micrococcus flavus and Mycobacterium tuberculosis H37Rv."Biochem.Biophys.Res.Commun.. 276・1. 57-63 (2000)

S. Kawai、S. Mori、T. Mukai、S. Suzuki、T. Yamada、W. Hashimoto 和 K. Murata：“黄微球菌和结核分枝杆菌 H37Rv 的无机多磷酸盐/ATP-NAD 激酶”Biochem.Biophys.Res .通讯..276・1.57-63 (2000)

S.Kawai,T.Mukai,S.Mori,S.Suzuki,W.Hashimoto & K.Murata: "Polyphosphate kinase, polyphosphate-glucokinase, and polyphosphate-NAD kinase in microorganisms and their applications."Res.Adv.in Biosci.& Bioeng.. 1. 19-26 (2000)

S.河合、T.向井、S.森、S.铃木、W.桥本