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Na^+/Ca^<2+>交換機構(NCX)遺伝子を発現させた細胞におけるNCX電流の検討

表达Na^+/Ca^<2+>交换机制(NCX)基因的细胞中NCX电流的检查

基本信息

批准号：
11770047
负责人：
綿野智一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Fukushima Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770047/
关键词：
NCX1遺伝子 Ca^<2+>Ca^<2+>イオノフォア NCX電流 CD-8

项目摘要

心室筋では,細胞内に高濃度のCa^<2+>を負荷すると強縮するため,NCX電流に対する細胞内Ca^<2+>濃度の影響の詳細な検討は難しい.継代培養可能で,かつ細胞内Ca^<2+>濃度を高くしても強縮しない細胞に,心筋型NCX遺伝子(NCX1)をトランスフェクトして安定発現株をクローン化し,簡便に心筋型NCX電流を測定できる系を確立するため以下の実験を行った.昨年度はNCX1のcDNAを作成,発現ベクター(pcDNA3)にサブクローニングし,各種細胞にリポフェクション法で発現した.何割かの細胞に発現していることはRT-PCRにより確認したが,発現した細胞を選別できなかった.(1)NCX1を過剰発現した細胞の選別;NCX1が過剰発現した細胞は,細胞内にCa^<2+>を負荷してもNCX1が上昇した細胞内Ca^<2+>を排出するため細胞死を起こさないことが知られている.このことを利用してNCX1が過剰発現した細胞細胞のみを選別するために,細胞の培地中にCa^<2+>イオノフォアA-23187あるいはイオノマイシンを加えて培養を試みた.Ca^<2+>イオノフォアの濃度を検討したが選別できなかった.(2)CD-8を発現させると金属のビーズを細胞のまわりにつけるために,可視的に発現細胞を見分けることができる.現在,CD-8とNCX1を共発現させる手法を検討中である.発現させるCD-8とNCX-1のcDNAの量とその比率時間などの検討を行なっている.共発現ができた後細胞に金属のビーズをまき,ビーズのついた細胞を指標にNCX1発現細胞と考え,NCX電流の測定を行う予定である.

The effects of NCX currents on intracellular Ca <2+> concentrations were investigated in detail. In vitro culture, it is possible to establish the system for the determination of NCX current in cells with high intracellular Ca^<2+> concentration and strong contraction. Last year, the cDNA of NCX1 was created, and the protein (pcDNA3) was found in various cells. The cells were identified by RT-PCR. (1) NCX1 is detected in the cells; NCX1 is not detected in the cells; intracellular Ca^<2+> is loaded; NCX1 is increased; intracellular Ca^<2+> is excreted; cell death is initiated. The cell culture medium is Ca^<2+>-A-23187. The cell culture medium is Ca^<2+>-A-23187. The cell culture medium is Ca ^<2 +>-A-23187. (2)CD-8 is detected in cells, visible in cells and visible in cells. Now,CD-8 and NCX1 are jointly developed. CD-8 and NCX-1 cDNAs were found in different quantities and ratios. A total of 100 cells were found after the detection of metal, and the detection of NCX current was determined.