膵腺房細胞アポトーシスとG1サイクリン発現に関する解析

胰腺腺泡细胞凋亡及G1细胞周期蛋白表达分析

• 批准号: 11770278
• 负责人: 阪上 順一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770278/
• 关键词: 膵腺房細胞; アポトーシス; G1サイクリン; CCK; PCNA; CYCLIN D1; G_1サイクリン; CYCLIN D_1; PAP

Wistar系雄性ラットにL-arginine monohydrochloride(Arg)4.5g/kg体重を単回腹腔内投与し、急性膵炎を作成した.このモデルは3日目までが急性膵炎進展期であり,急激に膵重量が減少し,組織学的にはduct-like tubular complexを呈するようになる.この際、0.5〜1日目に急激に膵腺房細胞アポトーシスが増加することが捉えられた。0,0.25,0.5,1,3,5,7,9,11,14日目に屠殺し、膵を摘出して組織学的・生化学的検索に供した。急性膵炎の進展期(0.5日後)に膵腺房細胞のBrdU標識率は上昇をみなかった(0.27±0.17%)にもかかわらず,PCNA陽性率は急激に上昇し(15.3±1.85%),膵のWstern blottingでは71kDの部位に強いPCNA発現を認めた.急性膵炎進展期における腺房細胞のPCNA(36kD)は、polymericであるかcyclin D1(35kD)などのG1サイクリンとの複合体として増加していることが想定された.Immunogold silver staining(IGSS)を用いた免疫組織化学では通常のHE染色で対染可能であるが、Cyclin D1は0.5日後にアポトーシス細胞に染色された。Western blottingにて膵1μgあたりのCyclin D1含有量を解析した結果、0.0221ng(0日),0.0254ng(0.25日),0,0257ng(0.5日),0.0575ng(1日)と膵炎発症1日後に増加した。引き続き急性膵炎進展期におけるcyclin D1mRNAの発現を確認した.AGPC法によりTotal RNAを抽出し,RT-PCR法によりcyclin D1mRNAの発現を内部標準G3PDH mRNAとの比(RGU:Relative Gene Unit)によって確認した.急性膵炎進展期のマーカーとしてPAP(pancreatitis associated protein)mRNAを併せて検出した.急性膵炎の進展に平行して,PAPmRNAは0.3846RGU(0日),0.9103RGU(0.25日),1.3636RGU(0.5日)と上昇した.この際,cyclin D1mRNAは0.029RGU(0日),0.1837RGU(0.25日),0.9506RGU(0.5日)と基礎値の32.8倍に著増した.本研究ではG1サイクリンとして、PCNAやCyclin D1以外にCyclin D2,Cyclin D3の解析を試みた。IGSSでは膵腺房細胞のCyclin D2,Cyclin D3の染色性に経時的な変動はみられず、mRNAレベルでもCyclin D2mRNA:1.342RGU(0日),1.775RGU(0.25日),1.691RGU(0.5日),Cyclin D3mRNA:0.843RGU(0日),0,822RGU(0.25日),0.686RGU(0.5日)と変動は捉えられなかったが、膵1μgあたりの蛋白含有量は、Cyclin D2で0.0126ng(0日),0.0248ng(0.25日),0.0038ng(0.5日),0.0723ng(1日)、Cyclin D3で0.0844ng(0日),0.0879ng(0.25日),0.0378ng(0.5日),0.2142ng(1日)とCyclin D1同様の1日後に増加する結果となった。急性膵炎進展期早期にG1サイクリンであるPCNAやcyclin D1の発現が増加することが確認され,進展期中期には蛋白レベルでCyclin D2,Cyclin D3も増加することが判明した。これらの知見より、急性膵炎進展期における腺房細胞の一部がG0期から一旦G1期に入り死滅する傍証が得られた.

将单剂量的L-精氨酸单盐氯化物（ARG）4.5g/kg体重延伸至胸骨腹膜内的雄性Wistar大鼠，以产生急性胰腺炎。该模型处于直到第三天的急性胰腺炎进展的阶段，胰腺重量突然减少，组织学上显示出管状管状复合物。目前，观察到胰腺腺泡细胞的凋亡突然从0.5天开始增加到1。胰腺在0,0.0,0.25,0.5,5,1,3,5,5,7,9,9,11和14天处置，胰腺被除去，并将其去除并进行组织学和生物化学搜索。尽管发生了急性胰腺炎（0.5天后），但胰腺腺泡细胞的BRDU标记率尚未增加（0.27±0.17％），但PCNA阳性速率迅速升高（15.3±1.85％），并且在71 kd in panic的71 kdic westin中，在71 kdic的位置中观察到了强度PCNA的表达。假定在急性胰腺发育过程中，PCNA（36 kd）的腺泡细胞随着G1细胞周期蛋白（例如细胞周期蛋白D1（35 kD））的复合物增加而增加。使用免疫染色（IGS）的免疫组织化学可以用正常的染色来对抗染色（IGS），但在0.5天后将细胞周期蛋白D1染色为凋亡细胞。在发作胰腺炎后一天，分析每μg胰腺胰腺炎的细胞周期蛋白D1含量的结果增加，0.0221ng（0天），0.0254ng（0.25天），0,0257ng（0.50天）和0.0575ng（0.0575ng），以及0.0575ng（0.0575ng（1日））。随后在急性胰腺炎发育期间证实了细胞周期蛋白D1 mRNA的表达。通过AGPC方法提取总RNA，并通过RT-PCR方法通过Cyclin D1 mRNA与内标准G3PDH mRNA（RGU）（相对基因单位）的比率确认Cyclin D1 mRNA。 PAP（胰腺炎相关蛋白）也被检测为急性胰腺炎发育的标志。与急性胰腺炎发育的进展同时，PAP mRNA增加到0.3846RGU（0天），0.9103RGU（0.25天）和1.3636rgu（0.5天）。目前，细胞周期蛋白增加到0.3846RGU（0.25天），0.9103RGU（0.25天）和1.3636rgu（0.5天）。 D1 mRNA显着增加到基本值的32.8倍，达到0.029 RGU（0天），0.1837 RGU（0.25天）和0.9506 RGU（0.5天）。在这项研究中，除PCNA和Cyclin D1外，我们尝试将细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白D3分析为G1细胞周期蛋白。在IGS中，随着时间的时间和mRNA水平，Cycliatic腺泡细胞中细胞周期蛋白D2和Cyclin d3的染色特性，Cyclin d2 mRNA：1.342RGU（0天），1.7755天（0.25天），1.691rgu（0.5天），1.691rgu（0.5天），Cyclin d3 mrna：0.84443 rrNA：（0天），cyclin d2 mRNA：1.342Rgu（0天），没有观察到变化。 （0.25天）和0.686RGU（0.5天），但每μg胰腺的蛋白质含量为0.0126ng（0天），0.0248ng（0.25天），0.0038ng（0.5天），0.0723ng（1天）和环蛋白D2。结果表明，D3在1天后增加，类似于细胞周期蛋白D1，为0.0844ng（0天），0.0879ng（0.25天），0.0378ng（0.5天）和0.2142Ng（1天）。据证实，在急性胰腺炎的早期阶段，G1环蛋白PCNA和细胞周期蛋白D1的表达增加，而在急性胰腺炎中期，蛋白质水平的细胞周期蛋白D2和细胞周期蛋白D3也升高。这些发现表明，急性胰腺炎进展过程中的某些腺泡细胞曾经在G0和G1期，并且被杀。

项目成果

阪上順一、加嶋 敬: "最新主要文献と解説-膵疾患"認定医専門医のための内科学レビュー. 1版1刷. 119-126 (2000)

Junichi Sakagami、Takashi Kashima：“最新主要文献和评论 - 胰腺疾病”第 1 版第 1 次印刷的内科医学评论。

阪上順一,加嶋敬: "最新主要文献と解説-膵疾患"認定医専門医のための内科学レビュー. 1版1刷. 119-126 (2000)

Junichi Sakagami、Takashi Kashima：“最新主要文献和评论 - 胰腺疾病”第 1 版第 1 次印刷的内科医学评论。

J.Sakagami,K.Kataoka,K.Kashima: "Splanchnic hemodynamic status of severe acute pancreatitis"J.Med.Ultrasonics. 27(4). 544-544 (2000)

J.Sakagami、K.Kataoka、K.Kashima：“重症急性胰腺炎的内脏血流动力学状态”J.Med.Ultrasonics。

K.Kataoka,M.Imoto,J.Sakagami: "Chronic Pancreatitis : Relation to Pancreatic Cancer"Journal of Biliary Tract & Pancreas. 21. 1001-1004 (2000)

K.Kataoka、M.Imoto、J.Sakagami：“慢性胰腺炎：与胰腺癌的关系”胆道杂志

J.Sakagami,K.Kataoka,K.Kashima: "Gastrointestinal and endocrine hormones in alcoholic pancreatitis"KAN-TAN-SUI. 40. 141-149 (2000)

J.Sakagami，K.Kataoka，K.Kashima：“酒精性胰腺炎中的胃肠道和内分泌激素”KAN-TAN-SUI。