DNA相同組換えを利用した結核ワクチン開発のための基礎研究

利用DNA同源重组开发结核疫苗的基础研究

基本信息

批准号：
11770306
负责人：
松葉隆司
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Tottori University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770306/
关键词：
DNA相同組換え recA intein マイコバクテリア

项目摘要

1.構造の異なる合成DNAを基質としてintein蛋白の基質特異性を検討したが、基質間における有意な結合能の差は認められなかった。2.野生型および一アミノ酸変異をもつ変異型intein蛋白をそれぞれ精製し、recA蛋白によるDNA組換え反応に対する影響を試験管内反応系で検討した。野生型と変異型inteinのDNA組換え効率に対する影響は異なり、変異型inteinは組換え反応を濃度依存性に著しく抑制した。一方、RecA蛋白によるDNA組換え反応を促進する因子である一本鎖DNA結合蛋白(SSB)として、大腸菌SSBをMycobacterium bovis(BCG)由来のrecA蛋白の反応系に用いると、大腸菌recA蛋白で必要なSSB量と比べ多量のSSBが、同等の反応産物を得るのに必要とされた。この結果は、マイコバクテリア由来のrecAやintein蛋白による本来の活性に、種特異的なSSBの必要性を暗示させた。RecA蛋白以外にも、DNA組換えや修復に関与する因子が存在するので、DNA修飾酵素とintein蛋白の関連性を検討した。DNAの相同領域の連結酵素であるT4リガーゼは、制限酵素消化で直鎖状としたφX174DNAと混合するとDNAを環状化しスーパーコイル化を誘導する。この反応系にintein蛋白を加えると、DNA間の連結によりDNA長鎖化が誘導される。この結果は、intein蛋白がDNA結合蛋白と協力し、生体内でDNAの機能維持に何らかの役割を担っている可能性を示唆するが、より直接的証拠を得るため更に詳細な解析が必要とする。3.Inteinを含むrecA遺伝子をゲノム上に残したまま、inteinを除去した成熟型recA遺伝子をゲノム上にインテグレートさせ、その発現蛋白によるDNA組換え効率の変化測定を試みているが、intein蛋白が依然存在するためか、有意な効率変化は認められない。完全にinteinを除去した形での解析が必要かもしれない。

1。使用具有不同结构作为底物的合成DNA研究了内元蛋白的底物特异性，但是观察到底物之间的结合能力没有显着差异。 2。纯化具有一种氨基酸突变的野生型和突变型蛋白，并在体外反应系统中检查了RECA蛋白对DNA重组反应的影响。野生型和突变蛋白对DNA重组效率的影响有所不同，突变蛋白以浓度依赖性方式显着抑制重组反应。另一方面，当大肠杆菌SSB用作单链DNA结合蛋白（SSB）时，在RECA蛋白中促进DNA重组反应的因素，在RECA蛋白的反应系统中，源自BCG菌肉杆菌（BCG）的RECA蛋白系统，需要较大的SSB来获得与SSB相比，需要较大的SSB。该结果表明，分枝杆菌衍生的RECA和内因蛋白的先天活性需要特定物种特异性的SSB。除了RECA蛋白外，DNA重组和修复中还涉及一些因素，因此研究了DNA修饰酶和内蛋白蛋白之间的关系。 T4连接酶是DNA同源区域中的链接酶，通过限制酶消化与线性φX174DNA混合，并诱导DNA循环和超涂层。当添加内元蛋白时，将DNA渴望通过DNA之间诱导。该结果表明，内元蛋白可以与DNA结合蛋白合作，并在维持体内DNA功能中起作用，但是需要进一步的详细分析才能获得更直接的证据。 3。虽然含有内素基因的基因仍保留在基因组中，但去除内部内部的成熟RECA基因被整合到基因组上，并且尝试使用表达的蛋白质的DNA重组效率的变化进行了尝试，但也许是因为内部蛋白仍然存在，因此未观察到效率的显着变化。可能有必要分析完全去除内部内部的内部。