DNA相同組換えを利用した結核ワクチン開発のための基礎研究

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1.構造の異なる合成DNAを基質としてintein蛋白の基質特異性を検討したが、基質間における有意な結合能の差は認められなかった。2.野生型および一アミノ酸変異をもつ変異型intein蛋白をそれぞれ精製し、recA蛋白によるDNA組換え反応に対する影響を試験管内反応系で検討した。野生型と変異型inteinのDNA組換え効率に対する影響は異なり、変異型inteinは組換え反応を濃度依存性に著しく抑制した。一方、RecA蛋白によるDNA組換え反応を促進する因子である一本鎖DNA結合蛋白(SSB)として、大腸菌SSBをMycobacterium bovis(BCG)由来のrecA蛋白の反応系に用いると、大腸菌recA蛋白で必要なSSB量と比べ多量のSSBが、同等の反応産物を得るのに必要とされた。この結果は、マイコバクテリア由来のrecAやintein蛋白による本来の活性に、種特異的なSSBの必要性を暗示させた。RecA蛋白以外にも、DNA組換えや修復に関与する因子が存在するので、DNA修飾酵素とintein蛋白の関連性を検討した。DNAの相同領域の連結酵素であるT4リガーゼは、制限酵素消化で直鎖状としたφX174DNAと混合するとDNAを環状化しスーパーコイル化を誘導する。この反応系にintein蛋白を加えると、DNA間の連結によりDNA長鎖化が誘導される。この結果は、intein蛋白がDNA結合蛋白と協力し、生体内でDNAの機能維持に何らかの役割を担っている可能性を示唆するが、より直接的証拠を得るため更に詳細な解析が必要とする。3.Inteinを含むrecA遺伝子をゲノム上に残したまま、inteinを除去した成熟型recA遺伝子をゲノム上にインテグレートさせ、その発現蛋白によるDNA組換え効率の変化測定を試みているが、intein蛋白が依然存在するためか、有意な効率変化は認められない。完全にinteinを除去した形での解析が必要かもしれない。