DNA相同組換えを利用した結核ワクチン開発のための基礎研究

利用DNA同源重组开发结核疫苗的基础研究

• 批准号: 11770306
• 负责人: 松葉 隆司
• 金额: $ 1.47万
• 依托单位: Tottori University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770306/
• 关键词: DNA相同組換え; recA; intein; マイコバクテリア

1.構造の異なる合成DNAを基質としてintein蛋白の基質特異性を検討したが、基質間における有意な結合能の差は認められなかった。2.野生型および一アミノ酸変異をもつ変異型intein蛋白をそれぞれ精製し、recA蛋白によるDNA組換え反応に対する影響を試験管内反応系で検討した。野生型と変異型inteinのDNA組換え効率に対する影響は異なり、変異型inteinは組換え反応を濃度依存性に著しく抑制した。一方、RecA蛋白によるDNA組換え反応を促進する因子である一本鎖DNA結合蛋白(SSB)として、大腸菌SSBをMycobacterium bovis(BCG)由来のrecA蛋白の反応系に用いると、大腸菌recA蛋白で必要なSSB量と比べ多量のSSBが、同等の反応産物を得るのに必要とされた。この結果は、マイコバクテリア由来のrecAやintein蛋白による本来の活性に、種特異的なSSBの必要性を暗示させた。RecA蛋白以外にも、DNA組換えや修復に関与する因子が存在するので、DNA修飾酵素とintein蛋白の関連性を検討した。DNAの相同領域の連結酵素であるT4リガーゼは、制限酵素消化で直鎖状としたφX174DNAと混合するとDNAを環状化しスーパーコイル化を誘導する。この反応系にintein蛋白を加えると、DNA間の連結によりDNA長鎖化が誘導される。この結果は、intein蛋白がDNA結合蛋白と協力し、生体内でDNAの機能維持に何らかの役割を担っている可能性を示唆するが、より直接的証拠を得るため更に詳細な解析が必要とする。3.Inteinを含むrecA遺伝子をゲノム上に残したまま、inteinを除去した成熟型recA遺伝子をゲノム上にインテグレートさせ、その発現蛋白によるDNA組換え効率の変化測定を試みているが、intein蛋白が依然存在するためか、有意な効率変化は認められない。完全にinteinを除去した形での解析が必要かもしれない。

1. The structure of different DNA matrix and intein protein matrix specificity, matrix to matrix, intentional binding energy difference 2. The wild-type protein was purified and recA protein was detected by DNA sequencing. The DNA composition of wild-type and heterotypic inteins is different in effect, and heterotypic inteins are concentration-dependent in inhibition. A gene encoding recA protein is required for the production of SSB, which is a key factor in the production of recA protein from Escherichia coli. These results suggest that the origin of recA and intein proteins is essential for their intrinsic activity and the need for species-specific SSBs. To investigate the relationship between DNA modification enzymes and intein proteins DNA linked enzymes in the same domain can be induced by restriction enzyme digestion, DNA cycling and DNA mixing. These anti-DNA systems involve intein protein addition, DNA linkage, DNA long locking and induction. The results showed that intein protein and DNA binding protein could play a role in the maintenance of DNA function in vivo, and more detailed analysis was necessary. 3. DNA sequence analysis of recA gene, protein, protein, Complete intein to remove the shape of the analysis is necessary