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アポトーシス細胞死における核構造変化に関与する分子の同定

鉴定参与凋亡细胞死亡中核结构变化的分子

基本信息

批准号：
11770575
负责人：
高橋淳
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

アポトーシス核変化の制御因子p74とp66とに相互作用する分子として、p74BPとp66BPを酵母のTwo-hybrid法で平成11年度にクローニングした。本年度は、それらの細胞レベルでの相互作用と細胞内局在を検討し、特異抗体を作成するための抗原として精製タンパクを得た。(1)細胞内での相互作用p74BPをFLAGタグとの融合タンパクとして、全長のp74、p74のC末端側断片、p74N末端側断片をmycタグとの融合タンパクとして、COS-7細胞に発現した。FLAGタグに対する抗体で、myc-p74-N末端側断片が共沈降し、mycタグに対する抗体でmyc-p74-N末端側断片とFLAG-p74BPが共沈降した。p66BPとp66との共免疫沈降には、今の所、成功していない。一因は、p66が核外移行シグナルを有するために、下記のように核に局在するp66BPと結合できないためかもしれない。(2)細胞内局在p74、p66、p74BP、p66BPをGFPとの融合タンパクとして培養細胞に発現させ、共焦点顕微鏡により、傾向タンパクの細胞内分布を調べた。p74とp66は、細胞質にびまん性に分布していた。p74BPは、核膜周囲に顆粒状に分布していた。p66BPは、核に局在していたが、その分布は、点状であった。細胞にスタウロスポリンでアポトーシスを誘導したところ、p66は、細胞膜に移行した。(3)特異抗体の作成p74BPおよびp66BPを大腸菌にHisタグとの融合タンパクとして発現し、ニッケルカラムで精製することを試みたが、水溶性の条件では、精製不可能であった。そこで、グアニジンを用いた変性条件でニッケルカラムに結合させ、8M尿素を含む緩衝液で溶出したところ、高純度の精製標本を得たため、ウサギに免疫して特異抗体を作成中である。

p74, p66, p74 BP, p66BP, yeast and Two-hybrid method This year, the interaction between the two cells and the intracellular structure was studied, and the antigen and protein were refined. (1)Interactions in cells p74BP FLAG, p74 full-length, p74 C-terminal fragment, p74 N-terminal fragment myc, COS-7 cells Flag-p74-N-terminal fragment co-deposited with myc-p74-N-terminal fragment co-deposited with Flag-p74-BP p66BP and p66 co-immunity to fall, now, successfully. Because p66 has a role in extra-nuclear migration, the following points are important for the integration of p66BP and p66BP. (2)The intracellular distribution of GFP was modulated by the fusion of p74, p66, p74BP and p66BP in cultured cells, confocal microscopy, and the intracellular distribution of GFP. p74, p66, cytoplasmic and sexual distribution. p74BP is distributed granular around the nuclear membrane. p66BP, nuclear bureau in,, dot Cell membrane migration (3)Specific antibodies were prepared from p74BP and p66BP by E. coli, and the fusion was developed and purified under conditions of water solubility. In addition, the preparation of specific antibodies can be achieved by using different conditions such as binding, dissolution, and purification in 8M urea buffer solution.