巨核球の多倍体化過程における細胞質分裂関連蛋白の解析

巨核细胞多倍化过程中胞质分裂相关蛋白分析

• 批准号: 11770588
• 负责人: 岩部 弘治
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11770588/
• 关键词: 巨核球; 多倍体化; 細胞質分裂; PLK-1; AIM-1; アンチセンス; CD34陽性細胞

巨核芽球性白血病細胞株、Meg-Jをヒドロキシウレア存在下で培養し、G1期に同調させた後、同調を解除し、K252aとTPOを添加して多倍体化させる。経時的に細胞を固定し、細胞質分裂に必須なPLK-1,AIM-1などのキナーゼや71番目のセリン残基がリン酸化されたvimentinなどの細胞質分裂関連蛋白の発現を、それぞれに対する抗体を用い、免疫組織染色、ウエスタンブロット法により検討した。その結果、巨核芽球性白血病細胞株、Meg-J細胞では多倍体化に際してもAIM-1やキナーゼや71番目のセリン残基がリン酸化されたvimentinといった細胞質分裂関連蛋白の発現が上昇し、71番目のセリン残基がリン酸化されたvimentinは分裂溝近傍に発現していた。次に、患者の同意の上で提供をうけた末梢血幹細胞、骨髄より純化したCD34陽性細胞をIL-3、TPO存在下で培養した後、さらにイムノビーズ法にて巨核球系細胞を純化し、これにAIM-1のアンチセンスオリゴを添加し、多倍体化に対する影響について検討を行った。しかし、この系においてアンチセンスを添加した細胞には若干の多倍体化の促進が認められたものの細胞数が少ないといった問題があり、有意な多倍体化が認められたとは言えなかった。多倍体化に関与すると考えられる上記の細胞質分裂関連蛋白の遺伝子やそのdominant negative formの遺伝子をmammalian expression vectorに入れてtet activator、Lac repressor遺伝子とともにCD34陽性細胞、Meg-J細胞にエレクトロポレーション法を用いて導入した。このtet、IPTGinducibleな系を用いて、巨核球の多倍体化に対する影響を検討した。しかし著明な多倍体化の誘導は不可能であった。遺伝子導入そのものが困難であったことが原因の一つと考えられたため、今後はウイルスベクターなどを用いて導入効率を上げて再検討する予定である。

Megakaryoblastic leukemia cell line, Meg-J, was cultured in the presence of TPO, and then polyploidized in the presence of TPO and K252a. PLK-1,AIM-1, and the 71 residues of the protein that are essential for cell fixation and cytokinesis in normal cells are detected by immuno staining and cytokinesis assay. As a result, the expression of cytokinase-associated proteins increased during polyploidization in megakaryoblastic leukemia cell lines and Meg-J cells, while the expression of cytokinase-associated proteins increased during polyploidization in AIM-1 and 71-mer and 71-mer and In addition, the patient's consent was provided to study the effects of peripheral blood stem cells, bone marrow purification, CD34-positive cells, IL-3 and TPO culture on megakaryocyte lineage cells purification, AIM-1 and polyploidization. The number of polyploidy cells in the system was increased. Polyploidization is related to the introduction of the dominant negative form of the cytokinesis associated protein into mammalian expression vectors such as tet activator, Lac repressor, CD34 positive cells and Meg-J cells. The effects of tet, IPTG inducible system and megakaryocyte polyploidization were discussed. It is impossible to induce polyploidy. A review of the reasons for the difficulty in introducing the gene into the system, and a review of the introduction efficiency in the future