シスイソプレン鎖延長酵素の構造と触媒機構の解明

顺式异戊二烯链延长酶的结构和催化机制的阐明

基本信息

批准号：
11780412
负责人：
張元偉
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至 2000
项目状态：
已结题

项目摘要

Micrococcus luteus B-P26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素を大腸菌中に大量発現させる系を構築し、酵素を大量に精製して、結晶化することに成功した。X線回折による高次構造解析を行い、シスイソプレン鎖延長酵素として初めてX線結晶構造を解析した。各サブユニットは10本のα-ヘリックスと6本のβ-シートから成っており、トランス鎖延長酵素と全く違う立体構造を持っていることが分かった。また、シスイソプレン鎖延長酵素に保存されている5つの領域はこの酵素の疏水性キャビティーの周りに存在することが判明した。また、部位特異的変異導入によるウンデカプレニル二リン酸合成酵素の触媒機能発現機構の解明を行った。以下の知見が得られた。1.77位Asnはアリル性基質の二リン酸部分に作用し、直接に触媒機能に関与している。78位のTrpはアリル性基質の疏水性プレニル鎖の結合に参与する。2.Region VにあるArg-197、Arg-203、Glu-216はホモアリル性基質の二リン酸を認識し、基質の結合や触媒機能に関与する。このことにより、シスイソプレン鎖延長酵素の基質認識機構はトランス鎖延長酵素と全く違うことが分かった。また、Region IIIのFS motifは同じ基質の疎水性炭素鎖及び二リン酸の結合に参与する。3.Region Iにある"Structural P-loop"、Asp-29、Arg-42はアリル性基質の二リン酸の結合に必須である。4.Phe-73、Ser-74及びGlu-216は生成物のプレニル鎖長の決定に参与する。現在、アリル性基質のプレニル鎖部分の結合部位の解析を部位特異的変異導入及びこの酵素のPhotoaffinity labelingにより行っている。

构建了一个系统以表达大量的大肠杆菌中小球B-P26的非依赖二磷酸二磷酸合酶，并大量纯化酶并结晶。高阶结构分析是通过X射线衍射进行的，并首次分析了X射线晶体结构，作为一种均方根链扩展酶。每个亚基由10个α-螺旋和6个β-片组成，发现与跨链扩展酶具有完全不同的三维结构。还发现，在该酶的氢化腔周围存在五个延伸酶的五个区域。此外，阐明了通过定分诱变的催化功能表达不依赖二磷酸合酶的机制。获得了以下发现：位置1.77 ASN作用于烯丙基底物的双磷酸一季部分，并直接参与催化功能。位置78处的TRP参与了烯丙基底物的氢键链烯基链的附着。 2。Arg-197，Arg-203和GLU-216区域中的GLU-216识别均匀的底物二磷酸盐，并参与底物结合和催化功能。这表明，牙化烯链延伸酶的底物识别机制与反式链扩展酶的底物识别机制完全不同。此外，区域III的FS基序参与了同一基板的疏水碳链和双磷酸盐的结合。 3。区域I中的“结构P-loop”，ASP-29和ARG-42对于在亚物种底物中结合二磷酸盐至关重要。 4。PHE-73，SER-74和GLU-216参与确定产物的前链长度。当前，通过该酶的位置定向诱变和光接触标记，分析了烯丙基底物的前链链部分的结合位点。