シスイソプレン鎖延長酵素の構造と触媒機構の解明

顺式异戊二烯链延长酶的结构和催化机制的阐明

• 批准号: 11780412
• 负责人: 張 元偉
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-11780412/
• 关键词: イソプレノイド; プレニルトランスフェラーゼ; シスイソプレン鎖延長酵素; ウンデカプレニル二リン酸合成酵素; X線結晶解析; 部位特異的変異導入; 部位的変異導入

Micrococcus luteus B-P26のウンデカプレニル二リン酸合成酵素を大腸菌中に大量発現させる系を構築し、酵素を大量に精製して、結晶化することに成功した。X線回折による高次構造解析を行い、シスイソプレン鎖延長酵素として初めてX線結晶構造を解析した。各サブユニットは10本のα-ヘリックスと6本のβ-シートから成っており、トランス鎖延長酵素と全く違う立体構造を持っていることが分かった。また、シスイソプレン鎖延長酵素に保存されている5つの領域はこの酵素の疏水性キャビティーの周りに存在することが判明した。また、部位特異的変異導入によるウンデカプレニル二リン酸合成酵素の触媒機能発現機構の解明を行った。以下の知見が得られた。1.77位Asnはアリル性基質の二リン酸部分に作用し、直接に触媒機能に関与している。78位のTrpはアリル性基質の疏水性プレニル鎖の結合に参与する。2.Region VにあるArg-197、Arg-203、Glu-216はホモアリル性基質の二リン酸を認識し、基質の結合や触媒機能に関与する。このことにより、シスイソプレン鎖延長酵素の基質認識機構はトランス鎖延長酵素と全く違うことが分かった。また、Region IIIのFS motifは同じ基質の疎水性炭素鎖及び二リン酸の結合に参与する。3.Region Iにある"Structural P-loop"、Asp-29、Arg-42はアリル性基質の二リン酸の結合に必須である。4.Phe-73、Ser-74及びGlu-216は生成物のプレニル鎖長の決定に参与する。現在、アリル性基質のプレニル鎖部分の結合部位の解析を部位特異的変異導入及びこの酵素のPhotoaffinity labelingにより行っている。

Micrococcus luteus B-P26 was successfully constructed, purified and crystallized in large quantities. X-ray crystallographic analysis of high-order structures Each of the three types of enzymes has a three-dimensional structure. The presence of a hydrophobic domain of the enzyme was identified during the preservation of the enzyme. A study on the mechanism of catalytic function development of diacid synthase by site-specific gene transfer The following is a summary of the results. 1.77 Asn is directly related to the catalytic function of the binary acid part of the organic matrix. Trp at position 78 is involved in the binding of hydrophobic molecules to a hydrophobic matrix. 2. Arg-197, Arg-203 and Glu-216 are the key factors for the recognition of the diacids in the heterogeneous matrix and the binding and catalytic functions of the matrix. The matrix recognition mechanism of this enzyme is to recognize the expression of this enzyme. The FS motif of Region III is involved in the binding of aqueous carbon and organic acids in the same matrix. 3. Region I refers to "Structural P-loop," Asp-29, Arg-42, and the binding of organic substrates to diacids. 4. Phe-73, Ser-74 and Glu-216 are involved in the determination of the length of the product. Now, the binding site analysis of the protein chain part of the protein matrix, the site-specific transformation and the Photoaffinity labeling of the enzyme are in progress.

项目成果

M.Fujihashi, N.Shimizu, Y. W.Zhang, T.Koyama and K.Miki: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Studies of Undecaprenyl Diphosphate Synthase from Micrococcus luteus B-P 26"Acta Crystallographica. D55. 1606-1607 (1999)

M.Fujihashi、N.Shimizu、Y. W.Zhang、T.Koyama 和 K.Miki：“来自藤黄微球菌 B-P 26 的十一异戊二烯基二磷酸合酶的结晶和初步 X 射线衍射研究”晶体学报。

Y.-W.Zhang,Y.Kharel,and T.Koyama: "Overexpression, Purification, and Characterization of Selenomethionyl Farnesyl Diphosphate Synthase of Bacillus stearothermophilus"J.Mol.Cata.B : Enzymatic. 10. 623-630 (2000)

Y.-W.Zhang、Y.Kharel 和 T.Koyama：“嗜热脂肪芽孢杆菌的硒代甲硫氨酰法尼基二磷酸合成酶的过表达、纯化和表征”J.Mol.Cata.B：酶学。

M.Fujihashi,N.Shimizu,Y.-W.,Zhang,T.Koyama,and K.Miki: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Studies of Undecaprenyl Diphosphate Synthase from Micrococcus luteus B-P 26"Acta Crystallographica. D55. 1606-1607 (1999)

M.Fujihashi、N.Shimizu、Y.-W.、Zhang、T.Koyama 和 K.Miki：“来自藤黄微球菌 B-P 26 的十一异戊二烯基二磷酸合酶的结晶和初步 X 射线衍射研究”晶体学报。

Y.-W.Zhang,X.-Y.Li,H.Sugawara,and T.Koyama: "Site-Directed Mutagenesis of the Conserved Residues in the Component I of Bacillus subtilis Heptaprenyl Diphosphate Synthase"Biochemistry. 38・44. 14638-14643 (1999)

Y.-W. 张、X.-Y. Li、H. Sugara 和 T. Koyama：“枯草芽孢杆菌庚烯基二磷酸合酶中保守残基的定点突变”生物化学 14638。 -14643 (1999)

Y.-W.Zhang and T.Koyama: "Biosynthesis Routes Diverting from Intermediates of Isoprenoid Biosynthesis to Related Products of the Metabolism in "Biopolymer" Vol.II"Wiley-VCH (in press). 40

Y.-W.Zhang 和 T.Koyama：“从类异戊二烯生物合成中间体转向“生物聚合物”卷 II 中代谢相关产物的生物合成路线”Wiley-VCH（出版中）。