植物由来カルス細胞を用いた天然ゴム生合成機構の解明

利用植物源愈伤组织细胞阐明天然橡胶生物合成机制

• 批准号: 25740041
• 负责人: 中村 武志
• 金额: $ 2.58万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2015-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25740041/
• 关键词: プレニルトランスフェラーゼ; 天然ゴム; セイタカアワダチソウ; カルス細胞; 酵素機能解析

セイタカアワダチソウの葉由来cDNAから、天然ゴム生合成系に必須とされるcis-prenyltransferase (CPT)、ファルネシル二リン酸合成酵素 (FPS)、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素 (GGPS)、イソペンテニル二リン酸異性化酵素 (IDI) の4種類の遺伝子全長クローニングを行い、pCold ProS2ベクターに挿入して、in vitroにおけるタンパク質発現を行った。ニッケルカラムにより精製したFPS、GGPS、IDIタンパク質に関しては、pH、触媒濃度、反応温度を検討して酵素の最適反応条件を決定した後、化学反応速度論的な解析を行い、酵素のキャラクタライゼーションを行った。一方、CPTをpENTR/D-TOPOベクターに導入して、クロナーゼ反応によりpH35GSベクターに導入した。そしてpH35GS/CPTをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウムに組み込んだ。形質転換したアグロバクテリウムをセイタカアワダチソウ由来カルス細胞へ感染させて、カルベニシリン、ハイグロマイシンを含むMS培地で培養した。1ヶ月後カルス細胞のゲノム解析を行った結果、pH35GS/CPTが組み込まれていることを確認できた。今後はこの変異型カルス細胞のゴム合成能、また生産するゴムの開始末端構造、鎖長などの変化を解析していく予定である。

From cDNA from the leaves of the Japanese salmon leaf, four genes were cloned into four genes: cis-prenyltransferase (CPT), farnesyldiphosphate synthase (FPS), geranylgeranyldiphosphate synthase (GGPS), and isopentenyldiphosphate isomerase (IDI), which are essential for natural gum biosynthesis systems, and protein expression was carried out体外。对于使用镍柱纯化的FPS，GGP和IDI蛋白，通过检查pH，催化剂浓度和反应温度来确定酶的最佳反应条件，然后进行化学反应动力学分析以表征酶。同时，将CPT引入了PENTR/D-TOPO载体，然后通过克隆酶反应引入PH35GS载体。然后通过电穿孔将PH35GS/CPT纳入农杆菌中。转化后的农杆菌被源自鳞状的愈伤组织细胞感染，并在含有卡替霉素和湿霉素的MS培养基中培养。一个月后，愈伤组织细胞的基因组分析证实了PH35GS/CPT已纳入。将来，我们计划分析这些突变愈伤组织细胞的橡胶合成能力的变化，以及产生的橡胶的起始结构和链长。

项目成果

Catalytic activity of farnesyl diphosphate synthase from Solidago altissima

一枝黄花法尼基二磷酸合酶的催化活性

• 发表时间: 2013
• 作者: ○Chihiro Ishizawa;Takeshi Nakamura;Norimasa Ohya
• 通讯作者: Norimasa Ohya