植物由来カルス細胞を用いた天然ゴム生合成機構の解明

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セイタカアワダチソウの葉由来cDNAから、天然ゴム生合成系に必須とされるcis-prenyltransferase (CPT)、ファルネシル二リン酸合成酵素 (FPS)、ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素 (GGPS)、イソペンテニル二リン酸異性化酵素 (IDI) の4種類の遺伝子全長クローニングを行い、pCold ProS2ベクターに挿入して、in vitroにおけるタンパク質発現を行った。ニッケルカラムにより精製したFPS、GGPS、IDIタンパク質に関しては、pH、触媒濃度、反応温度を検討して酵素の最適反応条件を決定した後、化学反応速度論的な解析を行い、酵素のキャラクタライゼーションを行った。一方、CPTをpENTR/D-TOPOベクターに導入して、クロナーゼ反応によりpH35GSベクターに導入した。そしてpH35GS/CPTをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウムに組み込んだ。形質転換したアグロバクテリウムをセイタカアワダチソウ由来カルス細胞へ感染させて、カルベニシリン、ハイグロマイシンを含むMS培地で培養した。1ヶ月後カルス細胞のゲノム解析を行った結果、pH35GS/CPTが組み込まれていることを確認できた。今後はこの変異型カルス細胞のゴム合成能、また生産するゴムの開始末端構造、鎖長などの変化を解析していく予定である。