トレニアin vitro重複受精系を用いた2つの精細胞の動態解析

利用Torenia体外双受精系统对两个精子细胞进行动态分析

基本信息

批准号：
12740453
负责人：
東山哲也
金额：
$ 1.41万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度までに、花粉管の先端が胚嚢内部の適切な位置で破裂して内容物を放出し始めると(初速12,000μm3/s)、片側の助細胞が平均わずか0.6sで崩壊して花粉管内容物を受け取るようすを明らかにしてきた(Higashiyama et al. 2000 Plant Physiol.)。そこでさらに、精細胞を核酸染色色素SYTOX Greenによって生体染色し、その動態を明らかにすることを目的とした。受精過程の観察は、胚嚢が観察のための励起光で予想以上にダメージを受けやすく、困難を極めているが、高感度ICCDカメラを導入し、これまでの冷却カラーCCDカメラよりもさらに高感度で観察できるようになった。蛍光を肉眼では見えないほどまで絞込んだ状態で、花粉管内部における精細胞核および花粉管核、さらにはその内部における染色体や核小体の挙動までも、100倍対物レンズで連続的に観察できるようになった。そして、胚嚢内部に放出された2つの精細胞が、花粉管内部での挙動とは異なり、それぞれ離れて独立に動く様子が明確になってきた。また、受精の瞬間の様子を明らかにするには、どの胚嚢で受精が起こるか推測することが重要であったが、これまで明確ではなかった。そこで培地の改変により受精率を向上させるとともに、花粉管を誘引する細胞をレーザー細胞除去により同定し、卵細胞のわきにある2つの助細胞が花粉管を誘引することを解明した(Higashiyama et al. 2001)。確実に受精が起こる胚嚢を予測できるようになり、現在、受精の瞬間の様子について明らかにすべく、さらに解析を続けている。また、当初の計画に基づき、GFPによる生殖細胞の観察やトランジェントアッセイを行うため、アグロバクテリウムによるin planta形質転換の試みを開始した。

到去年，据透露，当花粉管的尖端在胚胎囊内的适当位置破裂，并开始释放其内容物（最初的速度为12,000μm3/s）时，辅助细胞的一侧以平均0.6 s的速度倒塌，接收花粉管的内容（Higashiama antal antiol antiol antiol and andiol and。）。因此，目的是通过使用核酸染色染料Sytox绿色进一步阐明精子细胞的动力学。观察受精过程非常困难，因为胚胎囊比观察的激发灯更可能受到损害，但是随着引入高敏感性ICCD摄像头，比以前的冷却颜色CCD摄像机更有可能以更高的敏感性观察。随着荧光狭窄到肉眼看不见的点，花粉管内的精子细胞核和花粉管核以及花粉管内的染色体和核仁的行为现在可以用100x物镜连续观察。很明显，在胚胎囊内释放的两个精子细胞与花粉管内的行为的行为不同，并在它们之间独立移动。此外，为了澄清受精时刻，重要的是要推测将发生哪种胚胎囊肿，但到目前为止尚未清楚。因此，改变培养基可以提高受精率，并通过去除激光细胞来鉴定吸引花粉管的细胞，表明位于卵细胞旁边的两个辅助细胞吸引了花粉管（Higashiyama等，2001）。现在可以预测发生受精的胚胎囊，并正在进行进一步的分析以阐明受精时的情况。此外，根据原始计划，我们开始尝试用农杆菌转化植物学，以观察具有GFP的生殖细胞并进行瞬时测定。