トレニアin vitro重複受精系を用いた2つの精細胞の動態解析

利用Torenia体外双受精系统对两个精子细胞进行动态分析

• 批准号: 12740453
• 负责人: 東山 哲也
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12740453/
• 关键词: 重複受精; 花粉管; 胚嚢; 助細胞; 精細胞; トレニア; 顕微細胞操作; 動態解析; 裸出胚嚢; 生殖細胞; マイクロレーザー

昨年度までに、花粉管の先端が胚嚢内部の適切な位置で破裂して内容物を放出し始めると(初速12,000μm3/s)、片側の助細胞が平均わずか0.6sで崩壊して花粉管内容物を受け取るようすを明らかにしてきた(Higashiyama et al. 2000 Plant Physiol.)。そこでさらに、精細胞を核酸染色色素SYTOX Greenによって生体染色し、その動態を明らかにすることを目的とした。受精過程の観察は、胚嚢が観察のための励起光で予想以上にダメージを受けやすく、困難を極めているが、高感度ICCDカメラを導入し、これまでの冷却カラーCCDカメラよりもさらに高感度で観察できるようになった。蛍光を肉眼では見えないほどまで絞込んだ状態で、花粉管内部における精細胞核および花粉管核、さらにはその内部における染色体や核小体の挙動までも、100倍対物レンズで連続的に観察できるようになった。そして、胚嚢内部に放出された2つの精細胞が、花粉管内部での挙動とは異なり、それぞれ離れて独立に動く様子が明確になってきた。また、受精の瞬間の様子を明らかにするには、どの胚嚢で受精が起こるか推測することが重要であったが、これまで明確ではなかった。そこで培地の改変により受精率を向上させるとともに、花粉管を誘引する細胞をレーザー細胞除去により同定し、卵細胞のわきにある2つの助細胞が花粉管を誘引することを解明した(Higashiyama et al. 2001)。確実に受精が起こる胚嚢を予測できるようになり、現在、受精の瞬間の様子について明らかにすべく、さらに解析を続けている。また、当初の計画に基づき、GFPによる生殖細胞の観察やトランジェントアッセイを行うため、アグロバクテリウムによるin planta形質転換の試みを開始した。

Yesterday annual ま で に, pollen tube の apex が embryo 嚢 internal の appropriate な position で burst し て contents を release beginning し め る と (velocity mu 12000 m3 / s), the piece side の synergid が average わ ず か 0.6 s で collapse 壊 し て contents を pollen tube by け take る よ う す を Ming ら か に し て き た (Higashiyama et al. 2000 Plant Physiol. そ こ で さ ら に, sperm cells を nucleic acid dye pigment SYTOX Green に よ っ て body dyeing し, そ の dynamic を Ming ら か に す る こ と を purpose と し た. Fertilization の 観 は, embryo 嚢 が 観 examine の た め の wound up light で to think above に ダ メ ー ジ を by け や す く, difficult を め て い る が, Gao Gan ICCD カ メ ラ を import し, こ れ ま で の cooling カ ラ ー CCD カ メ ラ よ り も さ ら に Gao Gan degrees で 観 examine で き る よ う に な っ た. 蛍 light を macroscopic で は see え な い ほ ど ま で ground 込 ん だ で, pollen tube internal に お け る pure nucleus お よ び pollen tube nucleus, さ ら に は そ の internal に お け る chromosome や nucleosome の 挙 dynamic ま で も, 100 times polices レ ン ズ で even 続 に 観 examine で き る よ う に な っ た. そ し て, embryo 嚢 internal に release さ れ た 2 つ の が sperm cells, pollen tube internal で の 挙 dynamic と は different な り, そ れ ぞ れ from れ て independent に く others child が clear に な っ て き た. ま た, fertilization の instant の others child を Ming ら か に す る に は, ど の embryo 嚢 で fertilization が up こ る か speculation す る こ と が important で あ っ た が, こ れ ま で clear で は な か っ た. そ こ で petty の change - に よ り fertilization rate upward を さ せ る と と も に, pollen tube を decoys す る cells を レ ー ザ ー cells to remove に よ り with し, egg の わ き に あ る 2 つ の synergid が pollen tube を decoys す る こ と を interpret し た (Higashiyama et al. 2001). Indeed be に fertilization が up こ る embryo 嚢 を be で き る よ う に な り, now, fertilization の instant の others child に つ い て Ming ら か に す べ く, さ ら に parsing を 続 け て い る. ま た, の original plan に づ き, GFP に よ る germ cell の 観 examine や ト ラ ン ジ ェ ン ト ア ッ セ イ を line う た め, ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム に よ る in planta form quality planning in の try み を began し た.

项目成果

Higashiyama t, Yabe S, Sasaki N, Nishiyama T, Miyagishima S, Kuroiwa H, Kuroiwa T: "Pollen tube attraction by the synergid cell"Science. 293. 1480-1483 (2001)

Higashiyama t、Yabe S、Sasaki N、Nishiyama T、Miyagishima S、Kuroiwa H、Kuroiwa T：“助细胞对花粉管的吸引力”科学。

Higashiyama T,Kuroiwa H,Kawano S,Kuroiwa T: "Explosive discharge of pollen tube contents in Torenia."Plant Physiology. 122. 11-13 (2000)

Higashiyama T，Kuroiwa H，Kawano S，Kuroiwa T：“Torenia花粉管内容物的爆炸性排放。”植物生理学。

Higashiyama T: "Plant Electron Microscopy and Cytochemistry."Dashek WV ed., Humana Press, USA.. 300 (2000)

Higashiyama T：“植物电子显微镜和细胞化学。”Dashek WV ed.，Humana Press，美国.. 300 (2000)

東山哲也: "植物の受精の仕組みを解明"遺伝. (印刷中). (2002)

Tetsuya Higashiyama：“阐明植物受精机制”（出版中）。

東山哲也, 黒岩晴子: "受精"植物オルガネラの分化と多様性(仮題) 秀潤社 植物細胞工学シリーズ. (印刷中). (2002)

Tetsuya Higashiyama，Haruko Kuroiwa：“受精”植物细胞器的分化和多样性（暂定名称）Shujunsha植物细胞工程系列（2002年）。