オリゴ糖鎖ライブラリーによる細胞表層のグライコフォームデザイン

使用寡糖库进行细胞表面糖型设计

• 批准号: 12760051
• 负责人: 村田 健臣
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Shizuoka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12760051/
• 关键词: enzymatic synthesis; sulfated oligosaccharides; β-D-galactosidase; Le^x; fucosyltransferase; fucosyloligosaccharide; serum; transglycosylation; glycosphingolipid; cellulase; glycopeptide; lectin; oligosaccharide

硫酸化オリゴ糖は,細胞表面の糖タンパク質や糖脂質糖鎖に発現し,細胞接着や炎症反応に関与している.そこで,酵素法による硫酸化オリゴ糖の合成法の開発を試みた.Bacillus circulans β-D-ガラクトシダーゼの6-スルホガラクトシル化反応による特異な硫酸化二糖合成法を開発した.本酵素は,4-メチルウンベリフェリル6-スルホ β-D-ガラクトピラノシドを供与体基質とし,6-スルホガラクトシル基をGlcNAcに転移する反応を触媒した.その結果,HPAEC-PAD分析によりS6Galβ1-4GlcNAcとその構造異性体であるS6Galβ1-6GlcNAcが供与体基質あたり総収率は49%,モル比は1:3.5で生成することが明らかとなった.グルコースを受容体とした場合,その位置選択性は著しく変化し,S6Galβ1-2Glcが主に生成すると共にβ-(1-1)α,β-(1-3),β-(1-6)異性体が生成し,総収率は74%であった.Glcα-OMeを受容体として用いると,本酵素は41%の総収率で主にS6Galβ1-2Glcα-OMeがそのβ-(1-6)構造異性体とともに生成した.両反応ともに,β-(1-2)結合2糖の生成が優先的に起こった.対照的に,Glcβ-OMeを受容体に用いるとβ-(1-3),β-(1-6)二糖が生成し12%の低収率であった.これらの結果から,β-D-ガラクトシダーゼが触媒するS6Gal転移反応は,受容体基質のアノマー水酸基の立体配置に大きく依存することが示唆された.フコースを含むオリゴ糖鎖は,血液型抗原やガン糖鎖抗原として見出され,また受精卵の発生過程にも関与していることが明かとなっている.そこで,Le^x[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc]の効率的な酵素合成を行うために,各種動物血清中のフコシルトランスフェラーゼ活性のスクリーニングを試みた.その結果,ニワトリ血清中に高いフコシルトランスフェラーゼ活性を見出した.しかしながら高いフコシダーゼ活性を含んでいたので,DEAEセファロースによる部分精製を行ったところワンステップでフコシダーゼを除去することができた.また,反応液中にウシ血清アルブミンや界面活性剤を添加することにより効率よくフコシル化反応を行うことが可能であった.この様にして得られた知見を基に,Le^x構造を有するオリゴ3〜5糖[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ-pNPおよびGalβ1-4(Fucα1-3)GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcの効率的な合成を行うことができた.

Sulfation of glucose, glucose and lipid chains on the cell surface, and subsequent inflammation of the cell are involved. The development of sulfated disaccharide synthesis by enzyme method was also studied.Bacillus circulans β-D-sulfated disaccharide synthesis by enzyme method was developed. The enzyme is a 4-mer enzyme that catalyzes the reaction between GlcNAc and a 6-mer enzyme that provides a substrate and a 6-mer enzyme. As a result,HPAEC-PAD analysis showed that the structural heteromorph of S6 Galβ1- 4 GlcNAc was 49% and the ratio of S6Galβ1-6GlcNAc was 1:3.5. In the case of Glc α-OMe receptor, the site selectivity of S6 Gal β 1 - 2Glc receptor was changed to β-(1-1)α,β-(1-3),β-(1-6) heteromorph, and the yield was 74%.Glcα-OMe receptor was changed to β-(1-6) heteromorph, and the yield was 41%.β-(1-2)-linked 2-glycans are preferentially generated. In contrast,Glcβ-OMe receptors were used in the production of β-(1-3),β-(1-6) disaccharides with a low yield of 12%. As a result,β-D-D-D-D-D-D- The blood type antigen and the carbohydrate antigen are found in the egg development process. The enzyme synthesis of Le^x[Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc] was tested in various animal sera. The results showed that the serum activity was higher than that of the control group. The first step is to improve the quality of the products. In addition to the active agent in the serum, the active agent in the reaction solution can be added to the reaction solution. The structure of Le^x is composed of 3 ~ 5 sugars [Galβ1-4(Fucα1-3)GlcNAc, Galβ1- 4 (Fuc α 1 - 3) GlcNAcβ-pNP] and Galβ 1 - 4 (Fuc α 1 - 3) GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc.

项目成果

村田健臣: "機能性オリゴ糖鎖の構築"日本農芸化学会誌. 75. 576-579 (2001)

Takeomi Murata：“功能性寡糖链的构建”日本农业化学学会杂志 75. 576-579 (2001)。

村田健臣: "オリゴ糖酸化酵素を利用した生乳中ラクトースの定量"日本農芸化学会誌. 75. 447-449 (2001)

Takeomi Murata：“使用寡糖氧化酶测定原料奶中的乳糖”日本农业化学学会杂志 75. 447-449 (2001)。

Zeng,X.,Nakaaki,Y.,Murata,T.,and Usui,T.: "Chemo-enzymatic synthesis of glycopeptides carrying α-Neu5Ac (2-3)-β-D-Gal-(1-3)-α-D-GalNAc, β-D-Gal-(1-3)-α-D-GalNAc, and related compounds and analysis of their specific interactions with lectins."Arch.Biochem.

Zeng, X.、Nakaaki, Y.、Murata, T. 和 Usui, T.：“携带 α-Neu5Ac (2-3)-β-D-Gal-(1-3)- 的糖肽的化学酶合成α-D-GalNAc、β-D-Gal-(1-3)-α-D-GalNAc 和相关化合物以及它们与凝集素的特定相互作用的分析。”Arch.Biochem.

Ashida H,Yamamoto K,Murata T,,Usui T.and Kumagai H.: "Characterization of endo-α-N-acetylgalactosaminidase from Bacillus sp.and syntheses of neooligosacccharides using its transglycosylation activity."Arch.Biochem.Biophys.. 373. 394-400 (2000)

Ashida H、Yamamoto K、Murata T、Usui T. 和 Kumagai H.：“芽孢杆菌属内源 α-N-乙酰半乳糖胺酶的表征以及利用其转糖基化活性合成新寡糖。Arch.Biochem.Biophys.. 373” .394-400 (2000)

Murata T.: "Enzymatic synthesis of sulfated disaccharides utilizing β-D-galactosidase-catalyzed transglycosylation"Biosci., Biotechnol., Biochem.. 65. 2456-2464 (2001)

Murata T.：“利用 β-D-半乳糖苷酶催化的转糖基化酶促合成硫酸化二糖”Biosci.、Biotechnol.、Biochem.. 65. 2456-2464 (2001)