小腸上皮細胞および肝細胞におけるリポタンパク質形成・分泌制御に関する研究

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肝細胞や小腸上皮細胞からのapolipoproteinB(apoB)含有リポタンパク質顆粒形成・分泌機構を明らかにする目的で研究を行った。昨年度までにヒト肝癌由来HuH-7細胞からのapoB分泌をverapamilが抑制することを見出した。このとき小胞体内腔に存在する脂質の量が低下していたことから、verapamilはapoB-脂質複合体形成が行われる小胞体内腔への脂質輸送を阻害したことが示唆された。本年度はこの点に関してさらに検討を進めた。verapamilが小胞体内腔の脂質量を低下させた作用機構について、小胞体膜を介した脂質輸送機構が存在し、それをverapamilが阻害したという仮説をたて、検証をすすめた。まずHuH-7細胞から調製したmicrosome画分を用い、内腔に脂質を取り込む活性が存在するか否かを検討した。HuH-7細胞のmicrosome画分にATP再生系を加え、適当な標識脂質を加えて一定時間インキュベートしてその取り込みを検討した。検討に先立ち、微量の脂質を定量する手法を薄層クロマトグラフィー法とCu触媒による脂質酸化法を組み合わせて確立し、これをもとに回収した脂質の比放射活性を算出して結果の比較を行うことにした。また取り込みの基質としては^<14>C-acetate存在下で培養したHuH-7細胞の細胞質基質から抽出した脂質を用いることにした。こうしてcholesterol ester、triglyceride、cholesterolといった脂質の比放射活性がmicrosome内腔で経時的に増加する実験系を構築できた。そこでverapamilの作用を検討したところ、triglycerideの比放射活性の上昇が抑制された。この結果はなんらかの機構による内腔への脂質取り込みをverapamilが阻害したことを示している。microsome内腔への脂質の取り込みがverapamilによって低下する様子をin vitroで再現できたことより、小胞体膜上にverapamil感受性の脂質輸送機構が存在し、その活性がapoB含有リポタンパク質の形成に重要であることがさらに強く示唆された。