ウェルシュ菌のε毒素の活性化機構ならびにプロペプチド断片の機能解析

产气荚膜梭菌ε毒素激活机制及前肽片段功能分析

• 批准号: 12770138
• 负责人: 宮田 茂
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kagawa Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770138/
• 关键词: Clostridium perfringens; ε毒素; 毒素活性化; プロペプチド; 7量体; シナプトソーム

ウェルシュ菌ε毒素は、トリプシンやキモトリプシン、本菌自体が産生するλ毒素(サーモリシン様プロテイナーゼ)によって、N-末端領域とC-末端領域が共にプロセシングされて活性化される。平成12年度に4種の変異毒素(PD,ΔN-PD,ΔC-PD及びΔNC-PD)を用いて、εプロトキシンのC-末端領域のプロセシングが細胞毒性・致死活性の発現に必須であること明らかにした。今年度はε毒素の標的の一つと考えられている神経細胞の細胞膜との反応性を調べた。^<125>IラベルしたΔC-PDとΔNC-PDを、ラット脳シナプトソーム膜と反応させたところ、それぞれ約200kDaと約180kDaのSDS耐性高分子量複合体を形成した。一方、細胞毒性・致死活性を示さないPDとΔN-PDは、高分子量複合体を形成しなかった。また、^<125>I-ΔC-PDと^<125>I-ΔNC-PDを種々の濃度で混合して高分子量複合体を形成させたところ、約200kDaと約180kDaの間にブロードなバンドが確認されたことより、高分子量複合体は数分子の毒素からなることが示唆されたが、解像度が低すぎて何分子の毒素により高分子量複合体が形成されているのか判明しなかった。そこで解像度を上げるために、1毒素分子あたり1分子の^<32>Pでラベルした変異毒素(^<32>P-ΔC-PDと^<32>P-ΔNC-PD)を調製し、それらを種々の濃度で混合しシナプトソーム膜と反応させ、DNA sequence用ゲル装置を用いた高解像度SDS-PAGEを行った。その結果、2つのホモマルチマーの間に6つの分離したバンドが検出された。これらのことから、C-末端領域がプロセシングされて活性化したε毒素はラットシナプトソーム膜内で7量体を形成することが明らかになった(Miyata et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:13778-13783)。

The toxin is produced by the bacteria itself, and the N-terminal domain and C-terminal domain are activated together. 4 isotoxins (PD,ΔN-PD,ΔC-PD and ΔNC-PD) were used in the C-terminal domain of the toxin in 2012. This year, the target of ε-toxin is detected by the cell membrane of neurons.^ <125>The SDS-resistant high molecular weight complex of about 200kDa and about 180kDa was formed. One prescription, cytotoxicity, lethal activity, PD, ΔN-PD, high molecular weight complex formation The <125>concentrations of the two species were mixed to form high <125>molecular weight complexes. The concentrations of the two species were about 200kDa and about 180kDa. The high molecular weight complexes were identified as several molecules of toxins. The resolution of the high molecular weight complexes was low. A <32><32><32>high resolution SDS-PAGE was performed using a high resolution DNA sequencing kit. The result is that 2 of them are separated from each other. The C-terminal domain is activated to form a 7-molecule in the membrane (Miyata et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:13778-13783).

项目成果

Msigeru Miyata: "Cleavage of a C-terminal peptide is essential for heptamerization of Clostridium perfringens ε-toxin in the synaptosomal membrane"The Journal of Biological Chemistry. 276・17. 13778-13783 (2001)

Msigeru Miyata：“C 末端肽的切割对于突触体膜中产气荚膜梭菌 ε-毒素的七聚化至关重要”《生物化学杂志》276·17 (2001)。