ウェルシュ菌のε毒素の活性化機構ならびにプロペプチド断片の機能解析

产气荚膜梭菌ε毒素激活机制及前肽片段功能分析

• 批准号: 12770138
• 负责人: 宮田 茂
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kagawa Medical School
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770138/
• 关键词: Clostridium perfringens; ε毒素; 毒素活性化; プロペプチド; 7量体; シナプトソーム

ウェルシュ菌ε毒素は、トリプシンやキモトリプシン、本菌自体が産生するλ毒素(サーモリシン様プロテイナーゼ)によって、N-末端領域とC-末端領域が共にプロセシングされて活性化される。平成12年度に4種の変異毒素(PD,ΔN-PD,ΔC-PD及びΔNC-PD)を用いて、εプロトキシンのC-末端領域のプロセシングが細胞毒性・致死活性の発現に必須であること明らかにした。今年度はε毒素の標的の一つと考えられている神経細胞の細胞膜との反応性を調べた。^<125>IラベルしたΔC-PDとΔNC-PDを、ラット脳シナプトソーム膜と反応させたところ、それぞれ約200kDaと約180kDaのSDS耐性高分子量複合体を形成した。一方、細胞毒性・致死活性を示さないPDとΔN-PDは、高分子量複合体を形成しなかった。また、^<125>I-ΔC-PDと^<125>I-ΔNC-PDを種々の濃度で混合して高分子量複合体を形成させたところ、約200kDaと約180kDaの間にブロードなバンドが確認されたことより、高分子量複合体は数分子の毒素からなることが示唆されたが、解像度が低すぎて何分子の毒素により高分子量複合体が形成されているのか判明しなかった。そこで解像度を上げるために、1毒素分子あたり1分子の^<32>Pでラベルした変異毒素(^<32>P-ΔC-PDと^<32>P-ΔNC-PD)を調製し、それらを種々の濃度で混合しシナプトソーム膜と反応させ、DNA sequence用ゲル装置を用いた高解像度SDS-PAGEを行った。その結果、2つのホモマルチマーの間に6つの分離したバンドが検出された。これらのことから、C-末端領域がプロセシングされて活性化したε毒素はラットシナプトソーム膜内で7量体を形成することが明らかになった(Miyata et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:13778-13783)。

通过胰蛋白酶，胰胆红素和细菌本身产生的λ毒素（热蛋白酶样蛋白酶）处理N末端区域和C末端区域，通过处理N末端区域和C末端区域激活Welshε毒素。在2000年，使用四种突变毒素（PD，ΔN-PD，ΔC-PD和ΔNC-PD）来澄清ε-蛋白毒素的C末端区域的处理对于表达细胞毒性和致死活性至关重要。今年，我们研究了神经元与细胞膜的反应性，被认为是ε毒素的靶标之一。当 ^<125> I标记的ΔC-PD和ΔNC-PD与大鼠脑突触体膜反应时，形成了抗SDS耐药的高分子量复合物，约为200 kDa和约180 kDa。另一方面，没有细胞毒性或致死活性的PD和ΔN-PD并未形成高分子量复合物。此外，当 ^<125> I-ΔC-PD和 ^<125> I-ΔNC-PD以各种浓度混合以形成高分子重量复合物，在大约200 kDa至180 kDa之间证实了一个宽带，这表明高分子复合物的高分子复合物是高分子的高度均高于多数分子的几分摩尔克素组成的高分子，以确定许多分子的分子。为了增加分辨率，制备了突变毒素（ ^<32> p-ΔC-PD和 ^<32> p-ΔNC-PD），用 ^<32> p-Δnc-pd标记为每种毒素分子，以各种浓度混合，使用凝胶序列的高分辨率SDS-sequess进行DNA序列，以各种浓度混合，以各种浓度反应。结果，在两个同源物之间检测到六个单独的频段。这些结果表明，已被C末端区域处理和激活的ε-茶素形成大鼠突触体膜内的避孕药（Miyata等人（2001）J。Biol。Chem。276：13778-13783）。

项目成果

Msigeru Miyata: "Cleavage of a C-terminal peptide is essential for heptamerization of Clostridium perfringens ε-toxin in the synaptosomal membrane"The Journal of Biological Chemistry. 276・17. 13778-13783 (2001)

Msigeru Miyata：“C 末端肽的切割对于突触体膜中产气荚膜梭菌 ε-毒素的七聚化至关重要”《生物化学杂志》276·17 (2001)。