ウエルシュ菌ε毒素のレセプターの同定と細胞膜ラフトにおける7量体形成機構の解析

产气荚膜梭菌ε毒素受体的鉴定及质膜筏七聚体形成机制分析

• 批准号: 14770120
• 负责人: 宮田 茂
• 金额: $ 2.56万
• 依托单位: Kagawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-14770120/
• 关键词: Clostridium perfringens; ε毒素; detergent-resistant membrane; ラフト; MDCK細胞; コレステロール; スフィンゴ脂質; 7量体形成

ウエルシュ菌のε毒素は、超微量(3x10^<-11>M以下)でマウスを死に至らしめる。一方で、Madin-Darby canine kidney(MDCK)細胞に対して細胞毒性を示し、その細胞膜にイオン透過性の細孔であるSDS耐性の7量体を形成する。マウスに静脈内投与したε毒素が腎臓と脳・中枢神経系に局在することや感受性細胞が限定されることから、特異的なレセプターの存在が示唆された。また、ε毒素は、主にraftと呼ばれるスフィンゴ脂質とコレステロールに富む非イオン性界面活性剤不溶性膜領域(detergent-resistant membranes,DRMs)に結合し、DRMで7量体を形成することを明らかにした。さらに、DRM構成脂質の変化がMDCK細胞に対する細胞毒性に及ぼす影響を調べた。細胞膜中のコレステロールやスフィンゴミエリンを減少させた結果、毒素感受性が低下した。ε毒素の毒性発現には、DRMのintegrityが重要であると考えられた。一方、スフィンゴ糖脂質の減少は、感受性をむしろ亢進させた。反対に、細胞に外部からガングリオシドG_<M1>を取り込ませた場合、ε毒素の細胞毒性が顕著に低下した。ε毒素はガングリオシドG_<M1>に結合しなかったことより、レセプターに影響を与えていると考えられた。スフィンゴ糖脂質のどの部分が影響を与えているのか調べるために、スルファチド、アシアロG_<M1>、ガラクトシルセラミド、N-アセチルノイラミン酸、N-アセチルノイラミニルラクトース存在下で感受性を調べた結果、スルファチド存在下でわずかに感受性が低下した。一方、細胞をシアリダーゼ処理した場合、感受性が亢進した。これらのことから、DRM表面における陰性電荷の存在の変化が、ε毒素感受性を変化させていると考えられた。DRMに局在する特異的なレセプターを介して標的細胞に結合し、DRMのmembrane potentialにより超微量でも効率よく7量体を形成し、細胞膜に挿入することにより細孔をあけ、細胞死を引き起こしていると推察された。

B. werche细菌ε毒素的ε毒素在超痕量中导致死亡（<3x10^<-11> m）。另一方面，它对Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞表现出细胞毒性，并在细胞膜中形成一种抗SDS抗SDS的六聚体，一种可渗透的离子孔。提出了特定受体的存在，因为对小鼠静脉内施用的ε-毒素定位于肾脏，脑和中枢神经系统，并且细胞的敏感性受到限制。还揭示了ε毒素与富含鞘脂和胆固醇的耐洗涤剂膜（DRMS）结合，主要称为筏，并在DRM中形成六聚体。此外，研究了DRM组成型脂质变化对MDCK细胞的细胞毒性的影响。降低细胞膜中胆固醇和鞘氨质素会导致毒素敏感性降低。 DRM的完整性被认为对ε毒素的毒性表达很重要。另一方面，糖磷脂脂的降低实际上提高了敏感性。相反，当细胞从外部与神经节G_ <m1>掺入时，ε毒素的细胞毒性显着降低。 ε毒素被认为对受体有影响，因为它没有与神经节苷脂的G_ <m1>结合。为了确定糖磷脂脂的哪些部分影响，我们研究了在硫化物，ASIALOG_ <m1>，半乳糖基酰胺，N-乙酰基神经氨基乳糖的情况下的灵敏度，并发现在存在硫化物的情况下敏感性略有降低。另一方面，当细胞用唾液酸酶处理时，敏感性会提高。从这些原因中，人们认为DRM表面上存在负电荷的变化会改变ε-茶素的敏感性。据估计，它通过定位于DRM的特定受体与靶细胞结合，即使由于DRM的膜电位而导致的超强量也有效地形成了Hexamer，并通过将其插入细胞膜中，打开毛孔，从而导致细胞死亡。

项目成果

Shigeru Miyata: "Clostridium perfringens ε-toxin forms a heptameric pore within the detergent-in soluble microdomains of madin-darby canine kidney cells and rat synaptosomes."The Journal of Biological Chemistry. 277・42. 39463-39468 (2002)

Shigeru Miyata：“产气荚膜梭菌 ε-毒素在 madin-darby 犬肾细胞和大鼠突触体的可溶性微结构域内形成七聚孔。”生物化学杂志 277・42 (2002)。