髄液中の異常プリオン蛋白のImmuno-PCR法検出によるプリオン病診断法の開発

开发利用免疫PCR检测脑脊液中异常朊病毒蛋白的朊病毒病诊断方法

• 批准号: 12770320
• 负责人: 黒原 和博
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: 佐賀医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770320/
• 关键词: クロイツフェルト・ヤコブ病; プリオン病; プリオン; 迅速診断; 脳脊髄液; Immuno-PCR法

クロイツフェルト・ヤコブ病患者の脳脊髄液に極めて微量に存在すると推定される異常プリオン蛋白質の検出を目的として、Immuno-PCR法の開発を試みた。まず、一次抗体として異常プリオン蛋白特異的モノクロナル抗体15B3をPCR用チューブに固相化し、未処理の試料(クロイツフェルト・ヤコブ病患者脳脊髄液)を反応させ、二次抗体として、ビオチン化抗プリオン蛋白モノクロナル抗体、3F4を用いる系で、Immuno-PCR法を行った。抗原抗体反応の各段階およびPCRの各段階で様々な条件の調整を行った。感度を上げると偽陽性反応が出現し、感度を下げると疾患附照試料でも検出が一定しなかった。次に、検出感度と特異性の向上を目的として脳脊髄液試料の前処理を試みた。試料にリン酸タングステンとカルシウムを加えて異常プリオン蛋白を析出させ、グルタルアルデハイドでコーティング処理したPCR用チューブに固相化した。さらにプロテアーゼK処理で正常プリオン蛋白を消化した後、残った異常プリオン蛋白質をグアニジンチオシアネート処理で変性させて抗体との反応性を向上させた。この方法でも、抗原抗体反応の各段階およびPCRの各段階で様々な条件の調整を行ったが、感度を上げると偽陽性反応が出現し、感度を下げると疾患対照試料でも検出が一定せず、臨床応用可能な検出システムは確立できなかった。

ク ロ イ ツ フ ェ ル ト · ヤ コ ブ patients の 脳 spinal marrow fluid に extremely め て trace に exist す る と presumption さ れ る abnormal プ リ オ ン protein の 検 out を purpose と し て, Immuno - PCR method の 発 を try み た. Abnormal ま ず, an antibody と し て プ リ オ ン protein specific モ ノ ク ロ ナ ル antibody 15 b3 を PCR with チ ュ ー ブ に solid-phase し, not 処 Richard の sample (ク ロ イ ツ フ ェ ル ト · ヤ コ ブ patients 脳 spinal marrow liquid) を anti 応 さ せ, secondary antibody と し て, ビ オ チ ン turn resistance プ リ オ ン protein モ ノ ク ロ ナ ル antibodies, 3 f4 を い る で, Immuno-PCR method を lines った. Antigen-antibody reverse 応 応 each stage およびPCR each stage で sample 々な condition <e:1> adjustment を row った. Sensitivity on を げ る と pseudo positive anti 応 が し, sensitivity under を げ る と disorders as sample attached で も 検 が certain し な か っ た. The sensitivity と specificity of the に and 検 samples is raised to the を target, と て脳 て脳, and the pre-treatment of the spinal cord liquid sample を test みた. Sample に リ ン acid タ ン グ ス テ ン と カ ル シ ウ ム を plus え て abnormal プ リ オ ン protein precipitate を さ せ, グ ル タ ル ア ル デ ハ イ ド で コ ー テ ィ ン グ 処 Richard し た PCR with チ ュ ー ブ に solid phase change し た. さ ら に プ ロ テ ア ー ゼ K 処 Richard で normal プ リ オ を ン protein digestion し た after and residual っ た abnormal プ リ オ ン protein を グ ア ニ ジ ン チ オ シ ア ネ ー ト 処 Richard で - sex さ せ て antibody と の anti 応 sex を さ upward せ た. こ の way で も, antigen antibody against 応 の paragraphs order お よ び PCR の paragraphs order で others 々 の な condition adjustment line を っ た が, sensitivity on を げ る と pseudo positive anti 応 が し, sensitivity under を げ る と disorders according to sample seaborne で も 検 が certain せ ず, clinical 応 may な 検 out シ ス テ ム は establish で き な か っ た.