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アンチセンス法を用いた絨毛癌の遺伝子治療に関する基礎的研究

反义基因治疗绒毛膜癌的基础研究

基本信息

批准号：
12770913
负责人：
佐藤朝臣
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770913/
关键词：
絨毛癌ヒト絨毛性ゴナドトロピン遺伝子治療

项目摘要

絨毛癌細胞はhCGを過剰に分泌しており、一方で細胞表面にはhCG受容体が発現していることから、過剰に産生されるhCGを介したautocrine/paracrine機構と腫瘍の自己増殖機構との関連性が示唆される。そこで本研究では絨毛癌細胞において、hCGのβサブユニツト産生をアンチセンス法にて抑制することで,hCGをシグナルとしたautocrine/paracrine機構を阻害し絨毛癌細胞の増殖を抑制することを試みた。まずRT-PCR法によりhCGβcDNAを作成した。この遺伝子断片を3'-5'方向に転写されるように発現ベクターpcDNA3.1に挿入し,プラスミドpcDNA3.1 rCGβを作成,絨毛癌細胞株JArに形質導入した(reverse transfection)。geneticin耐性をselection markerとしてクローン化を行ったところ,hCGβ発現量の異なる種々のクローンが得られ,本手法によりhCGβ発現が抑制されることが示された。次に各クローン毎に,PCNA発現を指標として細胞増殖能を,TUNEL法を指標としてアポトーシス誘導能について検討行った。遺伝子導入によりhCGβ発現の低下したクローンにおいては,遺伝子未導入のJArあるいはpcDNA3.1のみ導入したJAr(rCGβ非導入)と比較してPCNA発現が低下し,TUNELを指標としたアポトーシス発現が高まることが示された。さらに,MTT法により培養経過中の生存細胞数の推移について検討すると,hCGβ発現の低下したクローンにおいては,培養開始後4日以降,遺伝子非導入のJArあるいはpcDNA3.1のみ導入したJAr(rCGβ非導入)と比較し生存細胞数は有意に減少した。以上の結果より,絨毛癌細胞株JArにおいて,hCGβ発現が細胞の増殖,アポトーシスに密接に関与している可能性が示唆された。

hCG secretion in choriocarcinoma cells is mediated by autocrine/paracrine mechanisms and the relationship between hCG receptors and tumor growth mechanisms. In this study, we tried to inhibit the proliferation of choriocarcinoma cells by hCG autocrine/paracrine mechanisms. hCGβcDNA was synthesized by RT-PCR. This gene fragment was inserted into pcDNA3.1 in the 3'-5' direction, and the reverse transfection of pcDNA3.1 rCGβ was performed. The gene tolerance selection marker is used to detect hCG β production. In each case,PCNA expression index and cell proliferation ability were discussed by TUNEL method. The expression of PCNA was lower than that of pcDNA3.1 when the gene was not introduced, and the expression of PCNA was higher than that of pcDNA3.1 when the gene was not introduced In addition, the MTT assay showed that the number of viable cells in culture decreased significantly after 4 days of culture, and the number of viable cells decreased significantly after 4 days of culture. The above results indicate the possibility of hCGβ expression in choriocarcinoma cell line JAr and cell proliferation, and the relationship between hCG β expression and cell proliferation.