癌の遺伝子治療用Epstein-Barrウイルスベクター開発の基礎的研究。

1.口腔癌培養細胞株における野生型Epstein-Barrウイルス(wEBV)の遺伝子発現パターンの検索:昨年度の実績報告書に記述したように、EBV感染細胞をクローニングするには、antibiotic resistance geneを組み込んだEBVベクターをこの感染実験系に使用する事が最も効率よくクローニングできる方法である。しかしながら、組換えEBV(rEBV)(ジイオセーフティーレベル3)に対する封じ込め施設が稼動していないため、rEBVからwEBV(バイオセーフティーレベル2)へ実験対象を変更せざる負えなかった。そこで、口腔癌培養細胞(sMISK、MISK81-5、HSC-3)あるいは胃癌培養細胞(MKN74)とEBV産生Bリンパ培養細胞(AKATA細胞)との共培養法を用いて、wEBVを上皮細胞に感染させた後、EBV感染上皮細胞をクローニングする目的で限界希釈法を施行した。その結果、wEBV陽性クローニング細胞をsMISK 50クローン中15(30%)クローンに認めた。MISK81-5では24クローン(58.6%)に、MKN74は21クローン(87.5%)およびHSC3には17クローン(73.9%)であった。In vitroにおける従来の報告のEBV感染効率に比較して、我々の感染実験系では高頻度にwEBV陽性クローニング細胞を得る事ができた。また、現在の所、口腔癌細胞株におけるEBV陽性細胞のクローニングに成功した報告がなく、我々のこの報告が最初である。このクローニング細胞を使用して、口腔癌におけるEBVの潜伏感染様式を検索の後、ウイルス蛋白による口腔癌のアポトーシス変化機構を検索する。2.EBV感染による口腔癌細胞のアポトーシス機構変化の検索:今後、DNA microarray法を用いて、EBV感染による口腔癌細胞の遺伝子発現の変化を網羅的に検索し、感染後に高発現しているアポトーシス関連遺伝子を捉える。同様に、潜伏期に発現しているEBVDNAを強制発現系を用いてアポトーシス関連遺伝子の発現を検索し、アポトーシス誘導に対する責任EBV遺伝子を決定する。決定後、EBV産生蛋白とアポトーシス関連蛋白の相互作用をBinding assay系で明らかにしていく。

1.口腔癌培養細胞株における野生型Epstein-Barrウイルス(wEBV)の遺伝子発現パターンの検索:昨年度の実績報告書に記述したように、EBV感染細胞をクローニングするには、antibiotic resistance geneを組み込んだEBVベクターをこの感染実験系に使用する事が最も効率よくクローニングできる方法である。しかしながら、組換えEBV(rEBV)(ジイオセーフティーレベル3)に対する封じ込め施設が稼動していないため、rEBVからwEBV(バイオセーフティーレベル2)へ実験対象を変更せざる負えなかった。そこで、口腔癌培養細胞(sMISK、MISK81-5、HSC-3)あるいは胃癌培養細胞(MKN74)とEBV産生Bリンパ培養細胞(AKATA細胞)との共培養法を用いて、wEBVを上皮細胞に感染させた後、EBV感染上皮細胞をクローニングする目的で限界希釈法を施行した。その結果、wEBV陽性クローニング細胞をsMISK 50クローン中15(30%)クローンに認めた。MISK81-5では24クローン(58.6%)に、MKN74は21クローン(87.5%)およびHSC3には17クローン(73.9%)であった。In vitroにおける従来の報告のEBV感染効率に比較して、我々の感染実験系では高頻度にwEBV陽性クローニング細胞を得る事ができた。また、現在の所、口腔癌細胞株におけるEBV陽性細胞のクローニングに成功した報告がなく、我々のこの報告が最初である。このクローニング細胞を使用して、口腔癌におけるEBVの潜伏感染様式を検索の後、ウイルス蛋白による口腔癌のアポトーシス変化機構を検索する。2.EBV感染による口腔癌細胞のアポトーシス機構変化の検索:今後、DNA microarray法を用いて、EBV感染による口腔癌細胞の遺伝子発現の変化を網羅的に検索し、感染後に高発現しているアポトーシス関連遺伝子を捉える。同様に、潜伏期に発現しているEBVDNAを強制発現系を用いてアポトーシス関連遺伝子の発現を検索し、アポトーシス誘導に対する責任EBV遺伝子を決定する。決定後、EBV産生蛋白とアポトーシス関連蛋白の相互作用をBinding assay系で明らかにしていく。