プリオン病原体増殖機構の分子生物学的解析

朊病毒病原体增殖机制的分子生物学分析

• 批准号: 13876033
• 负责人: 福岡 伸一
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13876033/
• 关键词: スクレイピー; ディファレンシャルディスプレイ; 核酸分解酵素; ミクロソーム; 細胞分画

スクレイピー罹患マウスの脳および対照として非罹患健常マウスの脳を採取し、テフロンホモジナイザーで処理した。低速遠心条件で細胞分画を行い、宿主核酸が含まれる核およびミトコンドリアを除去した。次に超遠心条件で細胞分画を行い、ミクロソーム画分を除去した。超遠心上清に、RNaseを加え、宿主由来の核酸を加水分解した。その後、核酸分解酵素を特異的に不活性化し、SDSとプロテネースKで処理した。罹患した動物組織の感染性を不活性化する方法として、強アルカリ処理、長時間プロテアーゼ処理などがあり、実験に使われた器具類は全てこの方法で処理した。得られた核酸画分をもとに、遺伝子ライブラリーを作成した。また、この画分をテンプテートとしたディファレンシャルディスプレイを、9種の下流プライマーと24種の上流プライマーを使って行った。結果をPAGEで解析し、バンドは放射性同位元素で標識した。この結果、スクレイピー罹患マウス脳で発現の増幅を認めた遺伝子断片を約100種同定した。この核酸断片を乾燥させたゲルから抽出し、特異的プライマーによる再増幅のあと、TAクローニングによるサブクローン化を行い、うち30クローンについて核酸配列を解析した。一方、プリオンタンパク質の生理学的存在意義を解析するため、プリオンタンパク質と同じく酸性pH凝集性を持ち、GPIアンカー型タンパク質であるGP2/THPの膜遊離機能を解析した。その結果、特異的なプロテアーゼが関与していることを明らかにした。また、脳変性疾患のモデルとして、キノリン酸毒性に関与する酵素ACMSDをクローン化し構造を決定した。JBC Vol.277,No.38,pp.35162-35167(2002)BBRC Vol.289,pp.1044-1048(2001)

The treatment of disease is very important. Cell sorting at low telecentric speeds removes host nucleic acids from the genome. In addition, under the condition of hypertelecentricity, the cell separation is removed. Super-far-center clearance, RNase addition, host-derived nucleic acid hydrolysis After that, nuclease specific inactivation, SDS and enzyme processing. Methods of inactivation of infectious tissues of infected animals include: treatment with high concentration of bacteria, treatment with high concentration of bacteria for a long time, treatment with high concentration of bacteria, treatment with high concentration of bacteria, and treatment with high concentration of bacteria. The first step is to create a database of all possible information. 9 kinds of downward flow, 24 kinds of upward flow The results were analyzed by PAGE and identified by radioisotope. As a result, there are about 100 kinds of identical fragments. The nucleic acid fragments are dried, extracted, amplified, and sequenced. Analysis of the physiological significance of the existence of a party, a party The result is that there is a special relationship between the two. The enzyme ACMSD is responsible for determining the structure of the disease. JBC Vol.277,No.38,pp.35162-35167(2002)BBRC Vol.289,pp.1044-1048(2001)