臍帯血由来間葉系幹細胞を用いた硝子軟骨形成の誘導

使用脐带血间充质干细胞诱导透明软骨形成

• 批准号: 13877242
• 负责人: 内尾 祐司
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Shimane Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13877242/
• 关键词: 臍帯血; 間葉系幹細胞; 軟骨細胞

母体に合併症のない症例より分娩時に両親の書類上の同意を得た後、臍帯血、胎盤血をヘパリン加採血した。検体は採取後24時間以内に処理を行った。前年度同様にPercoll(1.080g/ml)を用いた比重遠心法で単核球を分離した。分離した単核球をtype I collagen coatedプラスティックディッシュに播種(1×10^6cells/cm^2)し20%ウシ胎児血清を含むDMEM培地を用いて培養を行った。また、採取し分離した単核球の一部に対してフローサイトメトリーを用い表面抗原の発現を調べた。検索した表面抗原はCD14,29,34,44,68,105である。培養により接着性細胞の存在と、コロニーの形成が観察された。接着性の細胞が出現した時点でbFGF(5ng/ml)を添加し細胞の増殖を促進した。線維芽細胞様の細胞が十分増殖した培養皿に対してdexamethasone,beta-glycerol phosphate,ascorbic acidを含む骨芽細胞分化誘導培地を加えて培養を継続した。分化誘導培地を加えることにより細胞形態は線維芽細胞様の形態から立方状の形態へと変化し、Von Kossa染色により細胞周囲のカルシウムの沈着を認めた。また同時に、多核巨細胞の存在も示された。フローサイトメトリーによる表面抗原の検索では、CD29,44,105の発現を高率に認めた。血球系幹細胞のマーカーであるCD34の発現も認められた。以上から臍帯血、及び胎盤血中には比重遠心法により分離されるプラスティック接着性の細胞が存在し、骨芽細胞分化誘導培地により骨芽細胞へと分化誘導可能な細胞が存在することが示された。表面抗原においても従来の報告による血球系細胞のマーカーだけではなく間葉系細胞のマーカーも高率に発現していた。以上を確認してから、ヌード・ラットの皮下に移植しin vivoでの骨組織の誘導を試みた。しかし、明らかな骨・軟骨組織は観察できなかった。そのため、フローサイトメトリーを用いたより詳細な表面抗原の調査と、より選択的な間葉系幹細胞の分離や培養条件の検索を行って、より分化能が高い細胞群の準備方法を続けて検討している。

Examples of maternal comorbidities include collecting blood from the umbilical cord blood and placental blood after giving birth and obtaining written consent from the mother. The body will not be processed within 24 hours after collection. Percoll (1.080g/ml) was used in the previous year and was separated using the specific gravity telecentric method. Isolated type I collagen Coated プラスティックディッシュに seeding (1×10^6cells/cm^2) and 20% ウシ fetal serum をcontaining むDMEM cultivation ground を and いて culture を row った.また, take the した単nuclear ball part of the に対してフローサイトメトリーを and use the いsurface antigen の発appears to adjust べた. The surface antigen of the test is CD14, 29, 34, 44, 68, 105. The existence and formation of cells in cultured cells can be observed. Then, when the sex cells appear, bFGF (5ng/ml) is added to promote the proliferation of the cells. Line-dimensional bud cells are grown in a culture dish with dexamethasone, beta-glycerol phosphate, and ascorbic acid, which are used to induce bone bud cell differentiation. Differentiation inductionPedi を加えることによりCell morphologyはlinedimensional bud cell様のmorphologyからcubic のmorphologyへと変化し、Von Kossa staining is used to identify the surrounding areas of cells. At the same time, the existence of multinucleated giant cells is also shown. Frozen surface antigens and CD29, 44, and 105 are now recognized at a high rate. Blood cell stem cell stem cells are recognized as CD34. The above-mentioned specific gravity telecentric method separated and preserved the adhesive cells in umbilical cord blood and placental blood. In し, osteoblast differentiation is induced, osteoblast differentiation is induced, and osteoblast differentiation is possible. The presence of osteoblasts is indicated. The surface antigen is reported to be high in the blood cell lineage cells and mesenchymal lineage cells. The above is the confirmation of subcutaneous transplantation, in vivo induction of bone tissue and test of ヌード・ラットのsubcutaneous transplantation.しかし、明らかなbone・cartilage tissue は観看できなかった.そのため、フローサイトメトリーをUsing いたよりDetailed surface antigen investigationと、よりSelected mesenchymal stem cells The isolation and culture conditions of the cells are the same as the line and the method of preparing the cell group with high differentiation ability.