蛋白質のN-末端特異的蛍光標識法の開発と生細胞内メチル化DNAの直接検出法の開発

开发蛋白质N末端特异性荧光标记方法以及直接检测活细胞中甲基化DNA的方法

• 批准号: 13878149
• 负责人: 相本 三郎
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 2002
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-13878149/
• 关键词: N-末端特異的標識; メチル化DNA結合ドメイン; 過ヨウ素酸ナトリウム; グリオキシロイル基; 末端アミノ基; 選択的化学修飾反応; オキザロイル基

発生・分化・情報伝達などの高次の生命現象を分子レベルの生命現象と結びつける手法を細胞生物学の領域の研究に提供することを目的として本研究を企画した.モデル実験系として,遺伝子の長期抑制や発癌などへの関与が指摘されているCpGメチル化を取り上げ,N-末端特異的蛍光標識メチル化DNA結合ドメインを調製し,これによって生細胞中のDNAのメチル化量とそのパターンを蛍光顕微鏡により直接観察し,ゲノムDNA中のメチル化量とその分布をどこまで評価することが可能か否かを検証することとした.そのために,メチル化依存的転写リプレッサーのメチル化DNA結合ドメイン(MDBD)のアミノ末端部位に対応する一連のペプチドを化学合成し,そのアミノ末端にセリンを導入した.これらの標品を用いて,過ヨウ素酸ナトリウムによるセリンのグリオキシロイル基への変換反応の条件検討をおこなった.その結果,反応を行う緩衝液のpHを調整することによって,トリプトファン含有ペプチドであっても副反応を防ぎつつ変換反応を行うことができることが判明した。また、蛍光物質の導入法について検討した結果、ヒドラジド体よりもシステイン付加体の方が穏和な条件下で蛋白質に導入できることが判明した。

The purpose of this study is to provide information on the development, differentiation, and transmission of high-level biological phenomena, molecular processes, and biological phenomena, and methods for research in the field of cell biology. The long term inhibition of DNA and its association with cancer development and the detection of CpG molecules are investigated by N-terminal-specific fluorescence labeling and DNA binding. The amount of DNA in the genome is estimated to be about 100 percent. The chemical synthesis of a chain of DNA binding sites (MDBD) at the terminal sites of MDBD is carried out by introducing a chain of DNA binding sites at the terminal sites of MDBD. This standard is used in a variety of ways, such as: As a result, the pH of the buffer solution was adjusted and the pH of the buffer solution was determined. In addition, the method of introducing fluorescent substances was studied. The results showed that the protein could be introduced under the condition of different concentrations of fluorescent substances.