簡便かつ高感度な遺伝子発現プロファイル解析法の開発

1、ブロモウリジン(BrU)を用いた新生RNA鎖の標識およびcDNAライブラリの作成遺伝子発現の経時的変化を簡便に解析する方法の確立を目的として、新生RNA鎖の選択的な標識と分離に重点を置きながら研究を行った。ヒートショックにより特定の転写反応を活性化(不活性化)した培養細胞をBrU存在下で短時間培養し、新生RNA鎖だけをBr標識した。total RNAを分離し定法に従いpolyA^+RNAを調製し、その一部を用いてコントロール用のcDNAライブラリを構築した。残りのpolyA^+RNAよりBr-RNAを抗Br抗体とそれに対する2次抗体が結合したマイクロビーズで分離し、cDNAライブラリを構築した。これらのcDNAクローンのインサート長は、polyA^+RNAを材料とした場合2〜3kbであるのに対し、Br-RNAを材料とした場合は200〜300bpであった。これはBr-RNAを分離する際の操作でRNAが断片化されたためと考えられ、改良の余地がある。cDNAクローンの性質を解析するため、それぞれのライブラリよりランダムに100個のクローンを選抜し塩基配列の決定を行った。新生RNA鎖のBr標識と特異的な選抜の効果を確認できたが、より多数のクローンの解析の必要性も明らかとなった。2、カイコESTデータベースを用いた遺伝子発現プロファイルの解析カイコのαチューブリンとβチューブリン遺伝子ファミリーの発生段階における特徴的な発現パターンを明らかにした。両チューブリン遺伝子ファミリーは、複数あるいは特定の組織・器官で発現するそれぞれ3、4種類の遺伝子より構成されており、発現しているαチューブリンとβチューブリンの組み合わせにより微小管の構造と機能が決定されるという仮説を確認できた。3、温度感受性変異株を用いた転写反応の解析遺伝子発現の基本的な反応機序を理解するために、緑色蛍光タンパク質GFPを結合したRNAポリメラーゼIIを安定に発現する哺乳類培養細胞株を樹立し、生細胞中で基本転写の速度論的な解析を行った。

1、ブロモウリジン(BrU)を用いた新生RNA鎖の標識およびcDNAライブラリの作成遺伝子発現の経時的変化を簡便に解析する方法の確立を目的として、新生RNA鎖の選択的な標識と分離に重点を置きながら研究を行った。ヒートショックにより特定の転写反応を活性化(不活性化)した培養細胞をBrU存在下で短時間培養し、新生RNA鎖だけをBr標識した。total RNAを分離し定法に従いpolyA^+RNAを調製し、その一部を用いてコントロール用のcDNAライブラリを構築した。残りのpolyA^+RNAよりBr-RNAを抗Br抗体とそれに対する2次抗体が結合したマイクロビーズで分離し、cDNAライブラリを構築した。これらのcDNAクローンのインサート長は、polyA^+RNAを材料とした場合2〜3kbであるのに対し、Br-RNAを材料とした場合は200〜300bpであった。これはBr-RNAを分離する際の操作でRNAが断片化されたためと考えられ、改良の余地がある。cDNAクローンの性質を解析するため、それぞれのライブラリよりランダムに100個のクローンを選抜し塩基配列の決定を行った。新生RNA鎖のBr標識と特異的な選抜の効果を確認できたが、より多数のクローンの解析の必要性も明らかとなった。2、カイコESTデータベースを用いた遺伝子発現プロファイルの解析カイコのαチューブリンとβチューブリン遺伝子ファミリーの発生段階における特徴的な発現パターンを明らかにした。両チューブリン遺伝子ファミリーは、複数あるいは特定の組織・器官で発現するそれぞれ3、4種類の遺伝子より構成されており、発現しているαチューブリンとβチューブリンの組み合わせにより微小管の構造と機能が決定されるという仮説を確認できた。3、温度感受性変異株を用いた転写反応の解析遺伝子発現の基本的な反応機序を理解するために、緑色蛍光タンパク質GFPを結合したRNAポリメラーゼIIを安定に発現する哺乳類培養細胞株を樹立し、生細胞中で基本転写の速度論的な解析を行った。