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マウス遺伝子改変の高効率化:ターゲティングベクターの正確かつ迅速な構築法

高效小鼠基因修饰：精准快速的靶向载体构建方法

基本信息

批准号：
15657041
负责人：
和田洋
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

遺伝子改変マウスの作出は,複雑なin vitroでの遺伝子操作,ES細胞の培養,そして胚操作による個体の作出など,多数のステップからなる長期の綿密な実験を必要とする.本研究では大腸菌内相同組換え法を導入することにより,BACクローン上で迅速に遺伝子改変を進める遺伝子構築技術を確立する.このため,セレクションマーカとしてジフテリア毒素Aフラグメントを発現するベクターを改変し,Srf I, Pme Iなどのrare restriction siteを組込み、ES細胞に導入する際に直鎖化するのに便利なプラスミド,pBSDT-AIIを作成した.次に,ES細胞内駆動用PGK promoterと大腸菌内用EM7 promoterのキメラプロモータを使用し,さらにはES細胞内でNeoを選択的に除去できるようにするため,flp recombinaseの認識サイトとlox Pを両端にもつ遺伝子カセットをもつプラスミド,pGPS21loxFRTNeoを作成した.このカセットを実際にES細胞内に形成導入した結果,ES細胞にG418耐性を付与することが示された.さらに第三のlox Pを挿入するため,pMODloxZeoDAmp-3を構築した.このplasmidはTn5のtranspositionに必須な領域に挟まれた形でloxP-Zeo-loxPカセットを有しており,試験管内での反応により,カセットを任意のDNAに挿入することができる.これらの遺伝子モジュールを用いてmVam2, V-ATPase a3について遺伝子破壊を進め、キメラマウスの作出と遺伝子破壊マウスの作成に成功した.本手法の導入によって多細胞生物の遺伝子変換の最初のステップをきわめて効率化・迅速化することができた.

In vitro, in ES cell culture, in vitro, in vitro In this study, we introduced the same group of E. coli into BAC cells, and established the gene construction technology. The rare restriction site of SrfI, Pme I was constructed to facilitate direct hybridization during ES cell introduction, and pBSDT-AII was constructed. In addition, PGK promoter and EM7 promoter in E. coli were used in ES cells, and Neo selection in ES cells was removed. flp recombinase was used to recognize the gene and pGPS21 loxFRTNeo was created. The results of the introduction of ES cells into ES cells showed that ES cells were resistant to G418. PMODloxZeoDAmp-3 was constructed. The plasmid Tn5 must be transposed in the form of loxP-Zeo-loxP, and any DNA can be inserted into the plasmid. The enzyme was successfully produced by mVam2, V-ATPase a3. The method of introducing multicellular organisms into the genome is described in detail below.