臨床応用に向けたクロマチン免疫沈降PCR法を用いたp53機能解析法の開発

染色质免疫沉淀PCR法p53功能分析方法的开发及临床应用

• 批准号: 15659130
• 负责人: 加藤 俊介
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659130/
• 关键词: ChIPアッセイ; p53; 96穴プレート; 培養細胞; SaOS2,SF126

まず、酵母を用いたp53機能解析法(FASAY法)にて確認した内因性に正常型p53を有する2種類の培養細胞(A549:肺癌細胞(嚢胞腺癌)、C32TG:悪性黒色腫細胞)、内因性に機能変異型p53を有する3種類の培養細胞(HSC-4:頭頸部腫瘍細胞(扁平上皮癌):R248Q、T.Tn:食道癌細胞(扁平上皮癌):V272M、Mewo:悪性黒色腫細胞:E258K)を用いて、前年度の研究で設定したクロマチン免疫沈降とPCR条件を用いて、p53の下流遺伝子とされる36遺伝子(40 PCR fragment)のプロモーター領域へのp53蛋白質の結合能について網羅的な解析を行なった。その結果、過去に報告されたp53蛋白質の標的配列を有する下流遺伝子であっても、細胞によってはDNAとの結合が観察されない遺伝子も認められた一方、変異型p53蛋白質であっても、HDM2によるネガティブフィードバックを受けないために過剰発現を起こしている細胞では、部分的にDNA結合能力を回復する可能性が示された。また、p53のstatusあるいは由来組織のどちらかが同一であっても、p53に対する免疫沈降法で共沈するDNA配列が異なることが観察された。これらの結果は既知の下流遺伝子が単離された過程が過剰発現系を用いていたため内因性のp53の本来の標的ではなかった可能性もあるが、もう一つの可能性としてp53は変異特異的、組織特異的な修飾因子により下流標的配列の使い分けを行っている可能性も示唆するものであった。今後、様々な培養細胞を用いて、p53蛋白質に対するクロマチン免疫沈降と網羅的なPCR法から得られたp53標的下流遺伝子群のプロファイルを作成し、組織型や抗がん剤感受性情報を含んだデータベースと組み合わせることで、p53蛋白質の転写活性化に関与する種々の因子や治療標的分子のスクリーニングに応用できるものと考えられた。

First, we conducted comprehensive analysis of the binding ability of p53 to the promoter region of 36 genes (40 PCR fragment), which is considered to be the downstream gene of p53, using chromatin immunoprecipitation and PCR conditions set in the previous year's study using two types of cultured cells (A549: lung cancer cells (cystadenocarcinoma), C32TG: malignant melanoma cells), and three types培养细胞（HSC-4：头颈肿瘤细胞（鳞状细胞癌）：R248Q，T.TN：食管癌细胞（鳞状细胞癌）：V272M，MEWO：恶性黑色素瘤细胞：E258K），使用P53功能分析方法（Fasay方法）证实。结果，尽管某些细胞以前已经报道了具有p53蛋白的靶序列的下游基因，但在某些细胞中未观察到与DNA的结合，但表明即使是突变的p53蛋白也可以部分恢复过度表达的DNA结合能力，因为它们不会从HDM2中受到负面反馈，因此也可以部分恢复过表达的DNA结合能力。还可以观察到，即使p53的状态或从p53衍生的组织的状态相同，通过p53的免疫沉淀法共沉淀的DNA序列也不同。这些结果可能是使用过表达系统分离出已知的下游基因的过程，因此内源性p53不是最初的目标，但另一种可能性表明，p53可用于使用突变特异性和组织特异性修饰符来区分下游目标序列。将来，使用各种培养的细胞来创建从全面的PCR方法获得的p53靶标的下游基因的概况，并通过将它们与包含有关组织类型和抗癌药物敏感性信息的数据库相结合，因此人们认为它们可以应用于筛选涉及p53 Protein of P53 Protein and Thereapeutic Molecules Moleculles Moleculles Moleculles Moleculules of Tosscriptiation conscriptiation off-Cancer药物。