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進化分子工学を駆使した新規高機能金属酵素の開発

利用进化分子工程开发新型高性能金属酶

基本信息

批准号：
21K20535
负责人：
加藤俊介
金额：
$ 2万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-08-30 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、進化分子工学的手法を遷移金属錯体へと応用し、優れた触媒特性を発揮する新規高機能触媒を開発することを目的とする。具体的には、非天然の遷移金属錯体を補因子としてタンパク質に導入した「人工金属酵素」を構築し、指向性進化法（directed evolution）を駆使した遺伝子工学的な改変を実施する。2022年度は、鉄コロール錯体を補因子としてミオグロビンに導入した人工金属酵素を構築し、指向性進化法によるタンパク質反応場の改変を実施した。ミオグロビンのヘム結合サイトを構成する複数のアミノ酸残基を選定し、部位飽和変異導入（site-saturation mutagenesis）によりランダム化した変異体ライブラリをスクリーニングすることで、ABTSの酸化反応に対して高いペルオキシダーゼ活性を示す変異体を獲得することに成功した。この得られた変異体は、改変前の人工金属酵素と比較して、24倍高い反応初速度を示すことが判明した。加えて、鉄二核錯体やチアミン二リン酸を補因子とする人工酵素の開発にも現在着手しており、今後これらの人工金属酵素の指向性進化法による改変も実施する予定である。また、2022年度は、効率的な人工金属酵素の指向性進化を実現するために、オリゴペプチド（Strep-tag II）を精製タグに用いた新たなハイスループットスクリーニング（HTS）手法を確立した。本HTS手法は、安価なキチン粉末をクロマトグラフィー担体として用いて、人工金属酵素の指向性進化を細胞夾雑物非存在下で実現する強力な手法である。今後、このHTS手法を最大限に活用し、進化分子工学による高機能金属酵素の開発に着手する。

This study aims to develop new functional catalysts by evolutionary molecular engineering methods for the transfer of metal complexes and the development of novel catalytic properties. Specific non-natural migration metal complex compensation factors, such as the introduction of "artificial metal enzymes" to build, directed evolution, and so on to improve the implementation of genetic engineering. In 2022, the introduction of artificial metalloenzymes into the production of iron and iron complex elements and the improvement of their chemical reaction fields were carried out. A selection of site-saturation mutations in the composition of a plurality of amino acid residues in the ABTS system was successful. The results showed that the enzyme activity was 24 times higher than that of the original enzyme. The development and modification of the directed evolution of metalloenzymes by adding iron and iron dinucleases and their complementary factors are now under way. In 2022, the directional evolution of artificial metalloenzymes with high efficiency was realized, and the new Strep-tag II (HTS) method was established. The HTS method is a powerful method for the production of stable, stable and stable powders, supports, and directed evolution of artificial metalloenzymes in the absence of cell inclusions. In the future, the HTS method should be used to the maximum extent, and the development of high-function metalloenzymes in evolutionary molecular engineering should be started.