ヒト歯根膜DNAチップを用いた根尖性歯周炎の遺伝子病態解析

利用人牙周膜DNA芯片进行根尖周炎的遗传病理学分析

• 批准号: 15659454
• 负责人: 北村 正博
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659454/
• 关键词: DNAマイクロアレイ; 根尖性歯周病; 歯根膜細胞; 炎症性サイトカイン; 根尖性歯周炎

1)ヒト歯根膜DNAチップの作製当研究室において単離・同定して冷凍保存されているヒト歯根膜組織3'末端cDNAライブラリの遺伝子クローン約1500個を、pUC119ライブラリベクター特異的プライマーを用いたPCR法にて遺伝子増幅を行った。これらPCR増幅cDNAを、マイクロアレイスポッターにてガラススライド上に高密度固定し、ヒト歯根膜組織由来の約1500個の遺伝子が固定化されたヒト歯根膜DNAチップ(PerioGen Chip)を作製した。2)in vitro根尖性歯周炎モデルでの遺伝子発現解析炎症性サイトカインであるIL-1β、また歯周組織の修復・再生に関与しているFGF-2で培養ヒト歯根膜細胞の刺激実験を行い、in vitroで根尖性歯周炎の炎症期および創傷治癒期を再現した場合の遺伝子発現を解析した。FCS不含α-MEM培地にて24時間培養後、IL-1β(100ng/ml)あるいはFGF-2(100ng/ml)で刺激を行い、刺激12時間、24時間、48時間でそれぞれRNAを抽出した。蛍光色素にてサンプルを標識し、PerioGen Chipにて遺伝子発現解析を行った。その結果、IL-1βおよびFGF-2ともに、刺激24時間において著明な発現上昇を示す遺伝子群が検出された。次に、ヒト歯根膜DNAチップの根尖性歯周炎病態診断へ応用に向けたin vivoでの遺伝子発現解析を試みた。歯周外科手術時に採取した歯肉組織と培養歯肉線維芽細胞とにおける遺伝子発現をPerioGen Chipを用いて解析した。その結果、患者からの歯周組織で高い発現を示す遺伝子としてイムノグロブリン遺伝子やケモカイン遺伝子等の免疫担当細胞に特徴的な遺伝子が検出され、炎症組織での遺伝子発現解析の可能性が示された。

1) Preparation of DTM DNA in vitro. About 1500 cDNA fragments at the 3'end of DTM were isolated and frozen in our laboratory. pUC119 cDNA fragments were amplified by PCR. About 1500 DNA fragments from the root membrane tissue were immobilized at high density by PCR amplification. 2) In vitro analysis of the expression of the gene in periapical periodontitis, IL-1β, FGF-2 and the stimulation of cultured dental root membrane cells during the inflammatory phase and wound healing phase. FCS did not contain α-MEM. After 24 hours of incubation, IL-1β(100 ng/ml) and FGF-2(100ng/ml) were stimulated for 12 hours, 24 hours and 48 hours. Photochrome identification, PerioGen Chip identification and analysis The results showed that IL-1β and FGF-2 increased at 24 h after stimulation. In addition, the root membrane DNA of apical periodontitis is used to analyze the gene expression in vivo. PerioGen Chip is used for analysis of tissue culture and development of perioGen cells during dental surgery. The results showed that high levels of gene expression in peripheral tissues of patients were detected, and the possibility of gene expression analysis in inflammatory tissues was demonstrated.